端粒酶逆轉錄酶在急性壞死性胰腺炎大鼠中性粒細胞凋亡中的作用

任大賓 楊志文

1上海市松江區中心醫院消化內科，上海 201600；2上海市松江區中心醫院藥劑科，上海 201600

SAP是由胰腺局部炎癥所致，累及全身炎癥反應綜合征，繼而造成多器官功能障礙綜合征的臨床危重病。“白細胞過度激活學說”是SAP發病的重要機制之一。胰腺組織自身消化釋放內源性物質，激活中性粒細胞，使得其凋亡延遲，繼而釋放大量炎癥因子，引發“瀑布”效應，致使SAP患者出現全身炎癥反應綜合征[1-2]。傳統觀點認為，端粒酶逆轉錄酶(telomerase reverse transcriptase，TERT)僅在腫瘤細胞、生殖細胞、造血細胞中表達[3]。2008年Lepreux等[4]首次發現TERT在中性粒細胞胞質中表達。近年有研究報道，冠心病[5-6]、原發性卵巢功能不全患者[7]中性粒細胞TERT水平異常表達，中性粒細胞凋亡延遲，但迄今為止，未見SAP時中性粒細胞TERT表達水平的相關報道。因此，本研究探討TERE對急性壞死性胰腺炎(acute necrotizing pancreatitis，ANP)大鼠中性粒細胞凋亡的影響。

材料與方法

一、動物與分組

24只SPF級Sprague-Dawley雄性大鼠由上海斯萊克實驗動物有限公司提供，許可證號SCXK(滬)2017-0005。大鼠禁食12 h，自由飲水，按數字表法隨機分為正常對照組，ANP 3、6 h組[8]和TERT抑制劑BIBR1532干預組(BIBR1532組)，每組6只。ANP組大鼠采用胰膽管逆行注射5%牛磺膽酸鈉(1 ml/kg)造模，分別在造模后3、6 h處死，經心臟采血。BIBR1532組大鼠在造模前腹腔注射2 mg/kg TERT抑制劑BIBR1532(美國EMC公司)，每周3次，連續2周，于造模3 h后處死，經心臟采血。正常對照組大鼠未經任何處理。取各組大鼠胰腺組織，置10%甲醛溶液中固定。

二、方法

1．外周血中性粒細胞分離：采集的大鼠血樣本經1%葡聚糖沉淀紅細胞，取上層富含粒細胞的血漿，按1∶1容積加入大鼠淋巴細胞分離液，以1 500 r/min離心20 min，離心半徑9 cm。通過低滲溶液溶解紅細胞，Percoll密度梯度離心法分離中性粒細胞，采用臺盼藍、瑞氏染色檢測中性粒細胞存活率和純度。

2．中性粒細胞TERT mRNA檢測：應用熒光定量PCR法檢測中性粒細胞的TERT mRNA表達量。TERT正向引物序列為5′-CAGATGCGACCCCTATTC-3′，反向引物序列為5′-TGTAACCGGAGCAAACTC-3′；內參GAPDH正向引物序列為5′-TATCGGACGCCTGGTTAC-3′，反向引物序列為5′-CTGTGCCGTTGAACTTGC-3′。引物由上海生工生物工程股份有限公司設計合成。反應條件：95℃ 10 min，95℃ 15 s、60℃ 15 s，40個循環。通過儀器自帶軟件獲取Ct值，以公式2-ΔΔCt計算mRNA相對表達量。

3．中性粒細胞TERT蛋白及凋亡相關蛋白檢測：采用蛋白質免疫印跡法檢測TERT蛋白及凋亡相關蛋白Bcl-xL、Bax表達量。抗TERT、Bcl-xL、Bax單克隆抗體購自英國abcam公司，工作濃度均為1∶1 000；辣根過氧化物酶標記的二抗購自上海碧云天生物技術有限公司，工作濃度為1∶200。最后ECL發光，X片曝光、顯影、定影。Image J軟件分析各條帶灰度值，以目的條帶與內參條帶的灰度值比為蛋白相對表達量。

4．中性粒細胞凋亡檢測：取含2×106/ml中性粒細胞的RPMI1640培養液500 μl，均勻接種于24孔板，常規培養16 h后，依次加入2.5 μl Annexin V-FITC 和5.0 μl碘化丙啶(PI)溶液，上流式細胞儀檢測中性粒細胞凋亡。

5．血清TNF-α、IL-6檢測：收集與分離大鼠外周血血清，ELISA檢測試劑盒 (美國eBioScience 公司)檢測各組大鼠血清TNF-α、IL-6水平，按試劑盒說明書操作。

6．胰腺組織病理學檢查：取甲醛溶液固定的胰腺組織標本，常規石蠟包埋、切片，蘇木精-伊紅染色，光學顯微鏡下觀察組織病理改變。

三、統計學處理

結 果

一、各組大鼠中性粒細胞TERT mRNA及蛋白的表達

分離后的大鼠中性粒細胞瑞氏染色顯示細胞核呈桿狀或2～5分葉狀，符合中性粒細胞特征，純度>95%(圖1A)；臺盼藍染色顯示極少量細胞呈淡藍色，中性粒細胞存活率>97%(圖1B)。

圖1 外周血中性粒細胞特征 1A 瑞氏染色(×1000)；1B 臺盼藍染色(×100)

正常對照組、ANP 3 h組、ANP 6 h組、BIBR1532組外周血中性粒細胞TERT mRNA表達量分別為1.03±0.26、3.31±1.07、5.21±0.78、1.95±0.49，TERT蛋白表達量分別為0.09±0.03、0.43±0.12、0.58±0.11、0.22±0.07(圖2)，ANP 3、6 h 組TERT mRNA及蛋白表達水平高于正常對照組，而BIBR1532組低于ANP 3 h組，差異均有統計學意義(t值分別為5.08、12.52、2.82，6.92、7.69、4.05；P值均<0.05)。表明TERT mRNA及蛋白在ANP大鼠外周血中性粒細胞中高表達。

注：ANP為急性壞死性胰腺炎；TERT為端粒酶逆轉錄酶；BIBR1532為端粒酶逆轉錄酶抑制劑圖2 正常對照組(1)、ANP 3 h組(2)、ANP 6 h組(3)、BIBR1532組(4)大鼠外周血中性粒細胞TERT蛋白表達

二、各組大鼠中性粒細胞Bcl-xL、Bax蛋白的表達

正常對照組、ANP 3 h組、ANP 6 h組、BIBR1532組中性粒細胞的Bcl-xL蛋白表達量分別為0.19±0.05、0.50±0.07、0.85±0.04、0.40±0.11，Bax蛋白表達量分別為0.29±0.08、0.23±0.03、0.17±0.02、0.43±0.12(圖3)。與正常對照組比較，ANP 3、6 h組的Bcl-xL表達量上升(t值分別為7.75、16.30，P值均<0.05)，而Bax表達量下降(t值分別為4.22、6.74，P值均<0.05)；與ANP 3 h組比較，BIBR1532組Bcl-xL表達量下降(t=5.42，P<0.05)，而Bax表達量上升(t=5.59，P<0.05)。表明TERT表達量升高則抑制ANP大鼠外周血中性粒細胞凋亡。

三、各組大鼠中性粒細胞凋亡率

中性粒細胞體外培養16 h后，正常對照組、ANP 3 h組、ANP 6 h組、BIBR1532組外周血中性粒細胞凋亡率分別為(10.03±0.74)%、(7.99±0.27)%、(6.65±0.36)%、(22.98±2.86)%。ANP 3、6 h 組中性粒細胞凋亡率低于正常對照組，而BIBR1532組高于ANP 3 h組，差異均有統計學意義(t值分別為4.52、7.27、12.63，P值均<0.05，圖4)。

注：ANP為急性壞死性胰腺炎；TERT為端粒酶逆轉錄酶；BIBR1532為端粒酶逆轉錄酶抑制劑圖3 正常對照組(1)、ANP 3 h組(2)、ANP 6 h組(3)、BIBR1532組(4)大鼠外周血中性粒細胞Bcl-xL、Bax蛋白表達圖4 正常對照組(4A)、ANP 3 h組(4B)、ANP 6 h組(4C)、BIBR1532組(4D)大鼠外周血中性粒細胞流式細胞分析圖

四、各組大鼠血清TNF-α、IL-6水平

正常對照組、ANP 3 h組、BIBR1532組血清TNF-α水平分別為(96.67±27.12)、(382.30±46.33)、(206.88±36.42) ng/L，IL-6水平分別為(43.34±14.50)、(134.21±16.13)、(88.06±13.05)ng/L，ANP 3 h組TNF-α、IL-6水平均高于正常對照組，BIBR1532組TNF-α、IL-6水平均低于ANP 3 h組，差異均有統計學意義(t值分別為22.57、12.63,17.77、9.43；P值均<0.05)。表明TERT高表達可上調血清TNF-α、IL-6水平。

五、各組大鼠胰腺組織的病理改變

正常對照組大鼠胰腺組織結構完整，無間質充血、出血和腺泡細胞壞死。ANP組大鼠胰腺組織可見大量的炎癥細胞浸潤，小葉間隔增寬、結構破壞，組織壞死。BIBR1532組大鼠胰腺組織病理改變較ANP組明顯改善(圖5)。表明TERT高表達可加重ANP大鼠胰腺組織的炎癥損傷。

注：ANP為急性壞死性胰腺炎；BIBR1532為端粒酶逆轉錄酶抑制劑圖5 正常對照組(5A)、ANP 3 h組(5B)、ANP 6 h組(5C)、BIBR1532組(5D)大鼠胰腺組織病理改變(蘇木精-伊紅染色 ×400)

討 論

端粒酶為自身攜帶模板的核蛋白逆轉錄酶，由TERT、端粒酶RNA、端粒酶相關蛋白3個主要的亞單位組成。端粒酶是細胞凋亡延遲的關鍵信號分子[9]，通過端粒和非端粒保護機制，維持端粒長度和改善線粒體功能，抑制細胞凋亡。TERT是端粒酶活化的限速酶，其表達程度反映端粒酶活性水平[10]。

研究發現，動脈粥樣硬化大鼠在持續炎癥遞質刺激下，其動脈組織的端粒酶活性增加13倍[5]；不穩定型心絞痛患者外周血中性粒細胞端粒酶活性較健康者增加2倍，從動脈粥樣硬化患者的硬化斑塊分離出的中性粒細胞中端粒酶活性增加更顯著，其中35%患者的端粒酶活性增加50倍[6]；原發性卵巢功能不全患者外周血中性粒細胞的端粒酶活性下降3倍，加速細胞衰老過程，進而導致卵巢內卵泡的耗竭或功能失常[7]。

2011年von Figura等[11]報道端粒酶基因敲除小鼠胰腺外分泌腺的再生能力降低，顯示端粒酶參與急性胰腺炎的發生和發展。本研究結果顯示，ANP 大鼠外周血中性粒細胞的TERT mRNA及蛋白表達上調，細胞凋亡的時間延長，抗凋亡蛋白Bcl-xL表達水平上升，而促凋亡蛋白Bax表達水平下降，同時外周血 TNF-α、IL-6 等炎癥細胞因子水平也顯著升高。提示BIBR1532顯著下調中性粒細胞的TERT mRNA及蛋白表達，促進中性粒細胞凋亡，降低外周血炎癥因子水平，有效緩解ANP大鼠胰腺組織的炎癥損傷。然而，本研究未行BIBR1532時間及劑量依賴性效應觀察，存在一定的局限性。

利益沖突所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻聲明任大賓：實驗操作、論文撰寫、數據整理；楊志文：研究指導、論文修改、經費支持