抗黏液蛋白1單抗偶聯吉西他濱聚氰基丙烯酸正丁酯納米粒對胰腺癌模型動物抑瘤作用的實驗研究

張林 侯艷紅 李春梅 劉浩潤

中國人民解放軍總醫院第八醫學中心消化內科，北京 100091

【提要】 采用乳化聚合法制備負載吉西他濱(GEM)的納米微球(GEM-PBCA-NP)，應用化學交聯法將抗黏液蛋白1(MUC1)單抗偶聯GEM-PBCA-NP。采用皮下種植法建立胰腺癌荷瘤裸鼠模型，并隨機分為MUC1-GEM-PBCA-NP組、GEM-PBCA-NP組、GEM組、單純納米顆粒組(PBCA-NP組)和對照組。結果顯示，MUC1-GEM-PBCA-NP組裸鼠移植腫瘤的抑制率顯著高于其他各組，治療結束時的移植腫瘤重量顯著低于其他各組。提示MUC1-GEM-PBCA-NP對裸鼠移植腫瘤具有良好的抑制生長作用。

胰腺癌是嚴重威脅國人健康與生命的一種惡性腫瘤，近年來發病率及死亡率呈快速上升的趨勢。胰腺癌早期無明顯癥狀，難以發現，確診時大多為進展期，又缺乏有效的治療手段，故預后極差[1-2]。因此針對晚期胰腺癌有效而不良反應低的治療方法是目前研究的熱點。本課題組先期研究以抗表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor, EGFR)作為靶點，將抗EGFR抗體偶聯到載吉西他濱聚氰基丙烯酸正丁酯納米微球(EGFR-GEM-PBCA-NP)，用于治療胰腺癌移植瘤，結果顯示有一定的靶向性和抑瘤作用，但效果不甚理想[3-4]。近年來黏液蛋白1(mucin 1，MUC1)作為新的靶點進入了研究者的視野。因MUC1在胰腺癌組織的表達率高達80%[5-6]， 故本課題組將抗MUC1單克隆抗體偶聯到GEM-PBCA-NP，通過胰腺癌PANC1細胞株的體外實驗，顯示MUC1-GEM-PBCA-NP能抑制癌細胞的增殖[7]。本研究進一步行MUC1-GEM-PBCA-NP治療胰腺癌的動物體內實驗。

一、材料與方法

1．MUC1-GEM-PBCA-NP制備：MUC1單抗購自Abnova公司。GEM-PBCA-NP的制備參考李春梅等[3]方法。將GEM-PBCA-NP與抗MUC1單克隆抗體完全混合溶于pH7.4的SBF溶液, 低速磁力攪拌下按一定比例加入碳二亞胺溶液, 混均后離心取沉淀。超聲分散沉淀物后，用去離子水洗滌4遍，冷凍干燥獲取抗MUC1單抗與GEM-PBCA-NP的交聯物(MUC1-GEM-PBCA-NP)。應用激光散射粒度分析儀(Zeta sizer Nano ZS90型，英國馬爾文公司)觀察微球粒的大小及抗體的分布，計算包封率及載藥率。包封率=納米微球粒實際載藥量/總投藥量×100%；載藥率=納米微球粒實際載藥量/稱取的納米微球粒質量×100%。

2．體內抑瘤實驗：人胰腺癌細胞株PANC1由北京富眾科技發展有限公司提供,常規復蘇、培養、傳代。BALB/c裸鼠45只，5～6周齡，購自上海斯萊克實驗動物有限公司。參考馬琳等[8]及李春梅等[4]方法制備荷瘤裸鼠模型，即取0.2 ml(6×107/ml)PANC1細胞懸液注射于裸鼠右側腋部皮下，待瘤體最大徑>0.5 cm(需7～10 d)為建模成功。共39只裸鼠成功建模，按數字表法將其中35只隨機分為5組，每組7只。MUC1-GEM-PBCA-NP組，經尾靜脈注射2.5 mg/kg吉西他濱(gemcita bine, GEM)等藥劑量的MUC1-GEM-PBCA-NP；GEM-PBCA-NP組，經尾靜脈注射等藥劑量GEM-PBCA-NP；GEM組：經尾靜脈注射GEM 2.5 mg/kg；單純納米顆粒組(PBCA-NP組)，經尾靜脈注射等容積PBCA-NP；對照組，經尾靜脈注射等容積生理鹽水。每5 d重復治療1次，每3 d測量1次腫瘤長徑(a)和短徑(b)，計算腫瘤體積(V)，V=a×b2/2。實驗開始后第15天及第30天上IVIS·Lumina LT小動物活體成像系統(美國PerkinElmer)行活體生物發光檢測成像并記錄，生物發光實驗參考王劍超等[9]方法。第30天處死裸鼠，剝離瘤體稱重，計算抑瘤率。抑瘤率=[(對照組瘤重-實驗組瘤重)/對照組瘤重]×100%。

二、結果

1．各組納米粒子電鏡下觀察結果：MUC1-GEM-PBCA-NP組電鏡下觀察制備的納米顆粒形態為光滑的球形，藥物GEM細顆粒均勻地分散在聚合物基質中。GEM-PBCA-NP組和MUC1-GEMPBCA-NP組納米粒大小分別為(49.62±6.17)nm和(58.14±6.44)nm。 GEM-PBCA-NP組和MUC1-GEM-PBCA-NP組納米粒中GEM的包封率分別為(44.52±4.22)%、(47.19±3.63)%，載藥量分別為(7.24±0.71)%、(6.85±0.56)%。表面修飾后納米粒子并無明顯變化，表明MUC1-GEM-PBCA-NP靶向載藥納米粒子制備成功。

2．MUC1-GEM-PBCA-NP1的裸鼠移植瘤抑瘤效果：治療后30 d，MUC1-GEM-PBCA-NP組、GEM-PBCA-NP組、GEM組裸鼠的抑瘤率顯著高于PBCA-NP組及對照組，MUC1-GEM-PBCA-NP組抑瘤率又顯著高于GEM-PBCA-NP組、GEM組，差異均有統計學意義(P值均<0.05)，而GEM-PBCA-NP組與GEM組抑瘤率差異無統計學意義(圖1，表1)。

圖1 各組裸鼠移植瘤的生長曲線

3．裸鼠移植腫瘤的光子量變化：MUC1-GEM-PBCA-NP組、GEM-PBCA-NP組、GEM組、PBCA-NP組及對照組治療前移植瘤基礎光子量均值分別為3.44±0.56、4.01±0.59、3.79±0.61、4.20±0.62、3.64±0.56，各組間差異均無統計學意義；治療第15天移植瘤光子量均值分別為7.21±0.76、14.48±1.34、13.77±1.52、27.25±3.56、29.52±2.43，其中MUC1-GEM-PBCA-NP組顯著低于其余各組(P值均<0.05，圖2)，GEM-PBCA-NP組和GEM組又顯著低于PBCA-NP組和對照組(P值均<0.05)，其余組間差異均無統計學意義；治療第30天移植瘤光子量均值分別為9.46±0.89、17.27±1.89、18.43±1.98、36.15±4.98、38.382±4.22，其中MUC1-GEM-PBCA-NP組顯著低于其余各組(P值均<0.05)，GEM-PBCA-NP組和GEM組也顯著低于PBCA-NP組和對照組(P值均<0.05)，其余組間差異均無統計學意義。MUC1-GEM-PBCA-NP組給藥第15天和第30天的移植瘤光子抑制率分別為67.27%和74.29%。

圖2 治療15 d時MUC1-GEM-PBCA-NP組(2A)、GEM-PBCA-NP組(2B)、GEM組(2C)、PBCA-NP組(2D)及對照組(2E)裸鼠移植瘤的腫瘤生物活體發光成像圖

討論近年來納米載藥系統成為一個主要的研究方向。國內外已經有采用納米載藥系統進行胰腺癌治療的研究[10]，如金納米粒子、碳納米管、納米二氧化硅和超順磁性、氧化鐵納米粒子等無機納米粒子以及白蛋白納米粒子、殼聚糖納米粒子等有機納米粒子在胰腺癌診斷、治療方面已取得一定成績[11]，但仍有諸多問題需進一步解決，其中分子靶點問題是一個研究熱點。MUC是一類大分子量糖蛋白，在正常生理狀態下，MUC的表達具有明確的組織特異性和時間特異性[12]。在病理狀態下，MUC表達異常是許多疾病及腫瘤的特征，尤其在胰腺癌組織中，MUC1異常表達已被研究證實。已有研究以MUC1作為引導納米粒子的靶向分子，顯示在胰腺癌中具有良好的導向作用。張重捷等[13]制備了抗MUC1單克隆抗體靶向修飾的探針超順磁納米顆粒，體內實驗結果顯示，該納米顆粒可以選擇性地積聚在裸鼠移植瘤內，可作為磁共振檢查時特異性顯影劑使用，提示MUC1作為靶點治療胰腺癌的可行性。因此本研究也采用抗MUC1單克隆抗體靶向修飾載GEM納米微粒的類似策略。

聚氰基丙烯酸正丁酯納米微粒(PBCA-NP)作為藥物載體具有顆粒大小適中，可避免內皮網狀系統吞噬，快速分布于組織，具有優良的藥物緩釋作用, 本課題組前期的體外細胞實驗已顯示其良好的載藥及藥物釋放作用[14-15]。本研究結果顯示，MUC1-GEM-PBCA-NP對于裸鼠胰腺癌移植瘤的抑制作用明顯優于無抗體偶聯的GEM-PBCA-NP及GEM直接的藥物作用，而GEM-PBCA-NP與GEM的抑制作用未見明顯差異，提示抗MUC1單抗對于載GEM納米微粒的動物體內導向作用較為顯著，與本課題組前期的體外實驗結果一致。本研究通過腫瘤生長曲線、腫瘤體重計算及活體生物發光顯像等方法評估MUC1-GEM-PBCA-NP的抑瘤效果，各方法總體結果基本一致，其中以腫瘤體重計算的MUC1-GEM-PBCA-NP組抑瘤率略低于活體生物發光光子量計算的抑瘤率，但差異無統計學意義，初步證實了抗MUC1單抗修飾的載GEM納米微球在動物模型體內能夠通過血行轉運，克服內皮網狀系統吞噬等諸多不利因素的影響而到達胰腺癌移植瘤組織內，從而產生良好的抑制腫瘤生長的作用。

本研究是以模型動物為基礎的前臨床水平研究，結果具有局限性。納米微粒在人體內的情況更為復雜，人體的組織結構、血管淋巴管轉運、內皮網狀系統以及更為重要的人體免疫系統作用都與免疫缺陷的裸鼠有很大不同。因此對納米微粒的優化和在更為高等動物模型體內實驗研究將是下一步研究的工作重點。

利益沖突所有作者聲明無利益沖突