紅樹莓提取物通過miR-194-5p/PI3K/AKT信號通路抑制胃癌細胞增殖、遷移和侵襲的分子機制研究

楊學軍 全信保 王強

胃癌是常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，其發(fā)病率呈增長趨勢，嚴重威脅人類生命健康[1]。由于胃癌發(fā)病隱匿，早期缺乏典型的臨床特征，多數(shù)患者確診時已處于中晚期[2]。目前，胃癌的治療缺乏有效方法，尋找并研發(fā)用于治療胃癌的藥物尤為重要。紅樹莓俗稱覆盆子、托盤等，其營養(yǎng)物質豐富，被譽為“黃金水果”。紅樹莓富含原花青素、酚酸類、黃酮類和三萜等多種活性物質，具有抗動脈粥樣硬化、降血脂、抗氧化等活性[3-5]。研究顯示，紅樹莓提取物可降低肝癌SMMC-7721細胞的增殖能力，其作用機制與AKT通路調控的cyclinA-CDK2介導的S期阻滯有關[6]。但目前，紅樹莓提取物能否影響胃癌細胞的惡性表型還未知。微小RNA(miRNA)是一類小分子非編碼RNA，其參與調控腫瘤細胞的增殖、凋亡和遷移等惡性表型，可作為腫瘤治療的分子靶點[7]。有報道稱，miR-194-5p在胃癌組織和細胞系中表達下調，通過上調其表達可有效削弱胃癌細胞的增殖、遷移和侵襲能力，miR-194-5p有可能成為胃癌治療的分子靶點[8]。本研究以胃癌細胞AGS為研究對象，主要探討了紅樹莓提取物對AGS細胞增殖、遷移和侵襲的影響及其能否通過調控miR-194-5p發(fā)揮作用，以期為其用于胃癌的治療提供一定的實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細胞與試劑 AGS細胞系，中國科學院上海細胞庫；胎牛血清(FBS)，杭州四季青；RPMI 1640培養(yǎng)基、細胞計數(shù)試劑盒-8(CCK-8)和二喹啉甲酸(BCA)蛋白檢測試劑盒，北京索萊寶；LipofectamineTM 2000試劑盒，美國Invitrogen公司；miR-194-5p抑制劑(anti-miR-194-5p)、抑制劑陰性對照序列(anti-miR-NC)及PCR引物，上海吉瑪制藥技術；兔抗人基質金屬蛋白酶2(MMP-2)、基質金屬蛋白酶9(MMP-9)、磷酸化磷脂酞肌醇3-激酶(p-PI3K)和磷酸化的蛋白激酶B(p-Akt)抗體，美國Santa Cruz公司；RNA抽提試劑盒、逆轉錄試劑盒和PCR試劑盒，大連寶生物。

1.2 方法

1.2.1 紅樹莓提取物制備:紅梅提取物的制備參照文獻方法[9]：準確稱取100 g紅樹莓樣品，加300 ml 80%預冷乙醇，用乳化勻漿器攪拌提取4 h。離心15 min(3 500 r/min)后，將濾液真空旋轉濃縮至約5～10 ml，冷凍干燥。準確稱取一定量的干燥后產物，用磷酸鹽緩沖液(PBS)溶解，配置濃度為0.5 g/ml的母液，4℃保存，使用時培養(yǎng)基稀釋。

1.2.2 AGS細胞培養(yǎng)與轉染:用含10% FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)AGS細胞。取對數(shù)期AGS細胞，將其接種至6孔板中(2.5×105個/孔)。當細胞生長密度達80%時，用LipofectamineTM 2000脂質體法分別轉染anti-miR-NC、anti-miR-194-5p至AGS細胞。轉染12 h后，更換新鮮培養(yǎng)基，再培養(yǎng)24 h，RT-qPCR檢測細胞中miR-194-5p表達驗證轉染效果，并收集細胞備用。

1.2.3 細胞分組:未轉染的AGS細胞分為對照組(NC組)，不同濃度(20、40、80、160 mg/ml)紅樹莓提取物組，其中NC組細胞用常規(guī)培養(yǎng)基培養(yǎng)，不同濃度(20、40、80、160 mg/ml)紅樹莓提取物組細胞分別用含紅樹莓提取物終濃度為20、40、80、160 mg/ml的培養(yǎng)基干預。轉染anti-miR-NC、anti-miR-194-5p的AGS細胞用含紅樹莓提取物終濃度為80 μg/ml的培養(yǎng)基干預，記為80 mg/ml紅樹莓提取物+anti-miR-NC組、80 mg/ml紅樹莓提取物+anti-miR-194-5p組。

1.2.4 CCK-8檢測細胞增殖:取未轉染、轉染后的AGS細胞，均接種至96孔板中(2.5×104個/孔)，培養(yǎng)4 h后，棄培養(yǎng)基，按1.2.3分組處理。處理24 h后，加10 μl CCK-8，孵育2 h，用酶標儀(λ=450 nm)檢測各孔吸光度(A)值。

1.2.5 Transwell法檢測細胞遷移和侵襲:取未轉染、轉染后的AGS細胞，均接種至6孔板中(2.5×105個/孔)，培養(yǎng)4 h后，棄培養(yǎng)基，按1.2.2分組處理。處理24 h后，收集各組細胞，并將其密度調整為5.0×104個/ml。細胞侵襲：將Transwell小室置于24孔板中，上室鋪Matrigel基質膠，自然晾干后加100 μl細胞懸液。下室加500 μl培養(yǎng)基。培養(yǎng)4 h后，棄培養(yǎng)基，按1.2.2分組處理，處理24 h后，棄培養(yǎng)基，用多聚甲醛固定、結晶紫染色，顯微鏡觀察。隨機取5個視野，記數(shù)。遷移實驗無需鋪Matrigel基質膠，剩余操作步驟與同侵襲實驗。

1.2.6 蛋白質印跡法實驗檢測MMP-2、MMP-9、p-PI3K和p-AKT蛋白表達:未轉染、轉染后的AGS細胞，均接種至6孔板中(2.5×105個/孔)，培養(yǎng)4 h后，棄培養(yǎng)基，按1.2.2分組處理。處理24 h后，用RIPA試劑提取細胞中總蛋白。經BCA法定量后，行SDS-PAGE電泳。然后轉膜、封閉后，分別用MMP-2(1∶500)、MMP-9(1∶500)、p-PI3K(1∶1 000)、p-AKT(1∶1 000)和β-actin(1∶1 000)一抗孵育液在4℃冰箱中孵育過夜。洗膜后，用山羊抗兔二抗(1∶2 000)孵育液在37℃搖床中孵育1 h。加顯影液避光顯影，曝光拍照，Image J軟件分析MMP-2、MMP-9、p-PI3K、p-AKT相對于β-actin的表達量。

1.2.7 RT-qPCR實驗檢測miR-194-5p表達:取未轉染、轉染后的AGS細胞，均接種至6孔板中(2.5×105個/孔)，培養(yǎng)4 h后，棄培養(yǎng)基，按1.2.2分組處理。處理24 h后，用RNA提取試劑盒提取細胞中總RNA。經逆轉錄后，行PCR擴增。擴增程序為95℃ 3 min，95℃ 10 s，58℃ 30 s，72℃ 30 s，共35個循環(huán)。引物序列：miR-194-5p上游5’-GCGGCGGTGTAACAGCAACT

CC-3’，下游5’-ATCCAGTGCAGGGTCCGAGG-3’；U6上游5’-GCTTCGGCACATATACTAAAAT-3’，下游5’-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3’。2-△△Ct法計算miR-194-5p相對于U6的表達量。

2 結果

2.1 紅樹莓提取物抑制胃癌細胞AGS增殖活性 與NC組比較，胃癌細胞AGS經不同濃度(20、40、80、160 mg/ml)的紅樹莓提取物干預24 h后，細胞A值明顯降低(P<0.05)。見表1。

2.2 紅樹莓提取物抑制胃癌細胞AGS遷移和侵襲 與NC組比較，胃癌細胞AGS經不同濃度(20、40、80、160 mg/ml)的紅樹莓提取物干預24 h后，細胞遷移數(shù)和侵襲數(shù)明顯降低(P<0.05)，MMP-2、MMP-9蛋白表達明顯降低(P<0.05)。見圖1，表2。

表1 紅樹莓提取物對AGS細胞增殖活性的影響

圖1 Western Blot檢測MMP-2、MMP-9蛋白的表達

表2 紅樹莓提取物對AGS細胞遷移和侵襲的影響

2.3 紅樹莓提取物促進胃癌細胞AGS中miR-194-5p的表達 與NC組比較，胃癌細胞AGS經不同濃度(20、40、80、160 mg/ml)的紅樹莓提取物干預24 h后，細胞中miR-194-5p的表達明顯升高(P<0.05)。見表3。

表3 紅樹莓提取物對AGS細胞中miR-194-5p表達的影響

2.4 敲減miR-194-5p可降低紅樹莓提取物對胃癌細胞AGS增殖、遷移和侵襲的影響 轉染anti-miR-194-5p的胃癌細胞AGS中miR-194-5p表達量明顯低于轉染anti-miR-NC的細胞(0.39±0.03、1.00±0.09，t=19.290，P<0.05)，表明敲減miR-194-5p的AGS細胞構建成功。與轉染anti-miR-NC的AGS細胞比較，80 mg/ml的紅樹莓提取物作用的敲減miR-194-5p的AGS細胞A值升高(P<0.05)，遷移數(shù)和侵襲數(shù)升高(P<0.05)，MMP-2和MMP-9蛋白表達升高(P<0.05)。見表4，圖2。

表4 敲減miR-194-5p降低紅樹莓提取物對AGS細胞增殖、遷移和侵襲的影響

圖2 Western Blot檢測MMP-2、MMP-9蛋白的表達

2.5 紅樹莓提取物對胃癌細胞AGS中PI3K/AKT信號通路的影響 與NC組比較，胃癌細胞AGS經80 mg/ml的紅樹莓提取物干預24 h后，細胞中p-PI3K和p-AKT蛋白表達明顯降低(P<0.05)。而與轉染anti-miR-NC的AGS細胞比較，80 mg/ml的紅樹莓提取物作用的敲減miR-194-5p的AGS細胞中p-PI3K和p-AKT蛋白表達明顯升高(P<0.05)。見圖3，表5。

圖3 Western Blot檢測p-PI3K、p-AKT蛋白表達

表5 PI3K/AKT信號通路蛋白表達情況

3 討論

我國是紅樹莓的多產國之一，但目前對紅樹莓的研究尤其是其在醫(yī)藥用品的應用開發(fā)還不夠深入。近年來研究顯示，紅樹莓提取物具有抗腫瘤作用。有報道稱，紅樹莓提取物可能通過調節(jié)PTEN/AKT信號傳導途徑抑制肝細胞癌細胞增殖[10]。本研究結果顯示，胃癌細胞經不同濃度(20、40、80、160 mg/ml)的紅樹莓提取物干預24 h后，細胞A值、遷移數(shù)和侵襲數(shù)均顯著降低，這表明紅樹莓提取物可抑制胃癌細胞的增殖、遷移和侵襲能力，具有一定抗胃癌作用。細胞遷移和侵襲受多種基因分子及信號通路的調控。MMP是一類可降解細胞外基質的酶類，其中MMP-2和MMP-9是目前研究最多的影響腫瘤細胞遷移和侵襲的MMP。MMP-2和MMP-9可通過降解腫瘤細胞外基質，促進腫瘤細胞遷移和侵襲[11]。本研究結果顯示，紅樹莓提取物可降低胃癌細胞中MMP-2和MMP-9的蛋白表達，提示其可能通過調控MMP-2和MMP-9來抑制胃癌細胞遷移和侵襲。

miRNA參與調控腫瘤細胞的惡性表型，為腫瘤治療提供了分子靶點。研究已表明，miR-125b-5p[12]、miR-362[13]和miR-106b-5p[14]等多種miRNA參與胃癌的發(fā)展進程，是胃癌治療的潛在分子靶點。研究顯示，膀胱癌[15]、透明細胞腎細胞癌[16]、神經膠質瘤[17]、喉癌[18]和肝細胞癌[19]等腫瘤中miR-194-5p表達明顯降低，miR-194-5p作為抑癌基因參與這些腫瘤的發(fā)展進程；而miR-194-5p在卵巢癌[20]和乳腺癌[21]中表達升高，促進腫瘤細胞增殖、遷移和侵襲等，發(fā)揮促癌基因作用。Ding等[22]研究顯示，lncRNA TP73-AS1在胃癌組織和細胞系中表達上調，其通過靶向抑制miR-194-5p并上調SDAD1的表達來促進胃癌細胞生長和轉移，TP73-AS1/miR-194-5p/SDAD軸為胃癌的治療提供了潛在分子靶點。本研究結果顯示，紅樹莓提取物可有效促進胃癌細胞中miR-194-5p的表達，而敲減miR-194-5p降低紅樹莓提取物對胃癌細胞增殖、遷移和侵襲的抑制作用，提示紅樹莓提取物可能通過上調miR-194-5p表達來阻礙胃癌細胞增殖、遷移和侵襲。

PI3K/AKT信號通路是參與調控細胞增殖、凋亡等生命活動的重要通路，其在腫瘤中處于激活狀態(tài)，阻斷該通路可有效抑制腫瘤細胞的惡性表型[23]。近年來研究顯示，miRNA參與調控PI3K/AKT信號通路，進而影響腫瘤發(fā)展進程。例如，m2巨噬細胞源性外泌體miR-15a和miR-92a可通過調控PI3K/AKT/mTOR信號通路抑制神經膠質瘤細胞遷移和侵襲[24]；miR-15b通過抑制PI3K/AKT信號通路降低食道癌細胞的活力、遷移和侵襲，并促進食道癌細胞凋亡[25]；miR-489可通過靶向HDAC7阻斷PI3K/AKT途徑，進而抑制胃癌細胞增殖、遷移和侵襲[26]。本研究結果顯示，胃癌細胞經80 mg/ml的紅樹莓提取物干預后，細胞中p-PI3K和p-AKT蛋白表達明顯降低，提示紅樹莓提取物可抑制胃癌細胞中PI3K/AKT信號通路的激活；而敲減miR-194-5p降低了紅樹莓提取物對胃癌細胞中PI3K/AKT信號通路的抑制作用，進一步提示紅樹莓提取物可能通過靶向miR-194-5p進而抑制PI3K/AKT信號通路來發(fā)揮抗胃癌作用。

綜上，一定劑量的紅樹莓提取物能夠削弱胃癌細胞的增殖、遷移和侵襲能力，其作用機制可能與上調細胞中miR-194-5p表達并阻礙PI3K/AKT信號通路的傳導有關，具有治療胃癌的潛在價值。但本研究僅通過體外細胞進行了初步探究，尚需要在體內進一步驗證紅樹莓提取物的抗胃癌作用及具體的作用機制。