基于代謝組學研究乳酸菌素片對腹瀉小鼠的干預作用機制

楊妮，詹揚，萬建華，李穎萌，劉文君

(江中藥業股份有限公司,南昌 330004)

0 引言

抗生素是用于治療各種細菌感染或抑制致病微生物感染的有效藥物，日常生活中抗生素的不恰當使用帶來許多嚴重的并發癥，如抗生素耐藥、抗生素相關性腹瀉(antibiotic-associated diarrhea,AAD)等，已經引起了臨床的廣泛關注[1-2]。AAD作為抗生素使用的常見副作用之一，影響5%～70%使用抗菌藥物的成年患者[3]。因此，尋找解決AAD的替代藥物成為人們關注的焦點。后生元是對宿主健康有益的無生命微生物和/或其成分的制劑[4]。乳酸菌素作為一種后生元制劑，由純乳酸菌代謝產生，將脫脂乳經過殺菌和真空濃縮，再由乳酸菌發酵后干燥而制成，是改善腸道環境和調節腸道功能的傳統藥物，具有安全性高、易儲存和熱穩定性等優點[5-6]。前期研究發現乳酸菌素片能通過調節腸道菌群，有效改善小鼠的腹瀉癥狀[6]。代謝組學是近年來興起的從排泄物樣本(血漿或尿液等)中識別代謝標志物的組學技術平臺。生物樣品中的代謝產物有助于反映機體病理生理變化，對其定性定量檢查為疾病和藥物作用機制的研究提供了比傳統研究方法更為豐富全面的信息[7-8]。因此，本研究預利用基于UHPLC-Q-Exactive Orbitrap/MS的代謝組學分析方法，研究乳酸菌素片對腹瀉小鼠血清代謝產物的影響，深入探究乳酸菌素片干預腹瀉的代謝通路和可能機制，為臨床應用提供新的著眼點。

1 材料與方法

1.1 材料及試劑

1.1.1 實驗動物

SPF級雄性昆明小鼠24只，體重20±2 g，購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，動物許可證編號：SCXK(翔)2019-0004。小鼠在江中藥業實驗動物中心飼養，適應性喂養一周，自由進食飲水。

1.1.2 試劑與藥物

乳酸菌素片(批號：19070012，每片含乳酸菌素0.4 g)，江中藥業股份有限公司；硫酸慶大霉素(批號：20190122，含量≥590 U/mg)，福安藥業集團煙臺只楚藥業有限公司；鹽酸林可霉素(批號：20180818，含量≥90%)，河南新鄉華星藥廠。甲醇、乙腈、甲酸、丙醇和純水均為色譜級，美國Thermo Fisher Scientific公司。

1.1.3 儀器與設備

超高效液相色譜串聯傅里葉變換質譜UHPLC-Q Exactive HF-X，賽默飛公司；HSS T3色譜柱(100 mm×2.1 mm i.d.,1.8μm)，美國Waters公司；JXDC-20型氮氣吹掃儀，上海凈信實業發展有限公司；LNG-T88型臺式快速離心濃縮干燥器，太倉市華美生化儀器廠；SBL-10TD型超聲波清洗機300W-10L，寧波新芝生物科技股份有限公司；Centrifuge 5430R型高速冷凍離心機，德國Eppendorf公司；NewClassic MF MS105DU型電子天平，瑞士梅特勒公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物模型建立

小鼠灌胃硫酸慶大霉素和鹽酸林可霉素的混合溶液(1∶1,0.4 g/mL)，0.5 mL/只，每日2次，連續5 d，當小鼠糞便呈現軟濕，黃綠色水樣便，說明造模成功[9]。

1.2.2 分組及給藥

將造模成功的小鼠隨機分為模型組和乳酸菌素片組(n=8)，其余未處理為正常對照組。乳酸菌素片組給藥劑量(按乳酸菌素計)為：每天1.2 g/kg，每天灌胃2次，每次0.5 mL。空白組和模型組灌胃等量的無菌水，每天2次，連續給藥10 d。

1.2.3 標本采集與處理

小鼠每5天稱重一次。給藥結束時，根據之前的研究[10]，采用腹瀉評分來評估各組小鼠腹瀉的嚴重程度，評分標準為：0分(正常大便)；1分(輕度腹瀉伴濕軟便)；2分(中度腹瀉伴有未成形大便，輕度肛周染色)；3分(嚴重腹瀉伴水樣便和嚴重的肛周染色)。禁食12 h后，各組小鼠腹腔注射1%戊巴比妥鈉(0.6 mL/100 g)，腹主動脈取血至無抗凝劑的采血管中，靜置2 h后，3 000 r/min離心10 min，收集上層血清，-80℃保存。無菌條件下立即取出盲腸，將盲腸結扎后剪下稱重，游標卡尺精確測量盲腸長度，取出盲腸內容物后盲腸稱重，利用2次稱重差值計算盲腸內容物含量。盲腸指數和盲腸內容物指數計算公式如下[11-12]:

1.2.4 UPLC-MS檢測分析

（1）血清樣品前處理。將凍存的血清于37℃復融2 min，取100μL液體樣本于2 mL離心管中。400μL提取液(甲醇∶水=4∶1(體積比))含0.02 mg/mL的內標(L-2-氯苯丙氨酸)進行代謝產物提取。樣本溶液于冷凍組織研磨儀研磨6 min(-10℃，50 Hz)，后低溫超聲提取30 min(5℃，40 kHz)。將樣品靜置于-20℃，30 min，離心15 min(4℃，13 000g)，移取上清液至進樣瓶中進行上機。

（2）色譜條件。采用HSS T3色譜柱(100 mm×2.1 mm,1.8μm)；柱溫40℃。流動相A為5%乙腈水(含0.1%甲酸)，流動相B為47.5%乙腈+47.5%異丙醇+5%水(含0.1%甲酸)。梯度洗脫：0～3.5 min，0～24.5%B，流速0.40 mL/min；3.5～5 min，24.5%～65%B，流速0.4 mL/min；5～5.5 min，65%～100%B，流速0.4 mL/min；5.5～7.4 min，100%B，流速0.4 mL/min升至0.6 mL/min；7.4～7.6 min，100%～51.5%B，流速0.6 mL/min；7.6～7.8 min，51.5%～0%B，流速0.6 mL/min降至0.5 mL/min；7.8～9 min，0%B，流速0.5 mL/min降至0.4 mL/min；9～10 min，0%，流速0.4 mL/min。

（3）質譜條件。樣品質譜信號采集采用正負離子掃描模式，質譜掃描質荷比范圍m/z：70～1050。離子噴霧電壓，正離子電壓3 500 V，負離子電壓2 800 V，輔助加熱氣10 psi，離子源加熱溫度為400℃，20-40-60 V循環碰撞能，MS1分辨率70 000，MS2分辨率17 500。

1.2.5 數據處理及分析

LC-MS原始數據導入代謝組學處理軟件Progenesis QI(Waters Corporation，Milford，USA)進行基線過濾、峰識別、積分、保留時間校正等處理后得到數據矩陣，將其進行缺失值和歸一化處理，同時刪除QC樣本相對標準偏差(RSD)＞30%的變量，并進行log10對數化處理，得到最終用于后續分析的數據矩陣。將MS和MS/MS質譜信息與代謝公共數據庫HMDB(http://www.hmdb.ca/)和Metlin(https://metlin.scripps.edu/)數據庫進行匹配，得到代謝物信息。R軟件包ropls(Version1.6.2)進行PCA和OPLS-DA分析。顯著差異代謝物的選擇基于OPLS-DA模型得到的變量權重值(VIP)和student’s T檢驗p值來確定。通過KEGG數據庫(https://www.kegg.jp/kegg/pathway.html)進行的代謝通路注釋，獲得差異代謝物參與的通路。Python軟件包scipy.stats進行通路富集分析，并通過Fisher精確檢驗獲得與實驗處理最相關的生物學途徑。

采用SPSS 20.0軟件進行統計學分析，經方差齊性檢驗后，兩組間比較采用T檢驗，多組間比較采用單因素方差分析。各組結果均用平均值±標準差(mean±SD)表示，P＜0.05表示結果具有統計學差異，P＜0.01則表示結果有極顯著統計學意義。

2 結果與討論

2.1 乳酸菌素片對小鼠體重、腹瀉評分、盲腸長度及盲腸指數的影響

與正常組相比，模型組和乳酸菌素片組小鼠在給予抗生素造模后，體重均呈現緩慢升高趨勢，至給藥10 d結束時，模型組和乳酸菌素片組小鼠的體重均顯著低于正常組(P＜0.05)，兩組之間無統計學差異(P＞0.05)，如圖1（a）所示。腹瀉評分結果顯示，造模5 d后模型組和乳酸菌素組的腹瀉評分均升高，提示抗生素誘導的腹瀉模型造模成功。隨著給藥時間延長，腹瀉評分逐漸降低，給藥10 d時，乳酸菌素組的腹瀉評分降低至接近正常水平，如圖1（b）所示。盲腸長度和盲腸指數結果顯示，給藥10 d后，與正常組相比，模型組盲腸長度和盲腸指數均顯著升高(P＜0.05)，而與模型組相比，乳酸菌素組的盲腸長度顯著降低趨近于正常組(P＜0.05)，盲腸指數降低無顯著性差異，如圖1（c）、圖1（d）所示。

圖1 乳酸菌素對小鼠體重、腹瀉評分、盲腸長度和盲腸指數的影響

2.2 小鼠血清代謝輪廓分析

采用UPLC-TOF/MS進行樣本的分離和數據采集，各組小鼠在正、負離子模式下的總離子流質譜圖如圖2。由圖2可知，各組分在正負離子模式下均能較好分離，各組之間的保留時間、峰面積有一定差異。

2.3 血清代謝組學的初步分析

基于陰性和陽性模式下獲得的血清樣本代謝譜數據，對不同組之間的差異進行PCA分析，如圖3（a）、圖3（b）所示，各組數據的聚類較好，組間分布距離較遠，表明模型組和乳酸菌素片組的糞便代謝組發生了顯著的變化。對小鼠血清樣本進一步采用PLSDA分析，結果顯示正離子模式下有3個主成分：R2X=0.468，R2Y=0.968，Q2=0.916；負離子模式下有3個主成分，R2X=0.363，R2Y=0.941，Q2=0.886，如圖3（c）、圖3（d)。從PLS-DA得分圖中可以看出在正離子和負離子模式下空白組、模型組和乳酸菌素片組聚類明顯，各組之間顯著分離。為進一步驗證模型的可靠性和穩定性，對數據模型進行200次的置換檢驗驗證，如圖3（e）,圖3（f）所示，R2值始終在Q2值之上，且Q2回歸直線與縱坐標截距為負數，表明未出現過擬合現象，模型可靠圖3（e）,圖3（f）。

2.4 差異代謝物篩選

為篩選乳酸菌素片干預腹瀉小鼠后的顯著性差異代謝物，本研究采用OPLS-DA模型中的第一主成分VIP值＞1，各組之間的糞便代謝物Students’s T檢驗(T-test)中P＜0.05，并以變異倍數FC＞1.2或＜0.8為標準，共鑒定出潛在生物標志物16個，其中9個上調，7個下調，如表1～2所示，結果提示小鼠灌胃抗生素后，體內的部分代謝產物水平相比于正常組發生了顯著變化，灌胃乳酸菌素片10 d后，這些顯著性變化的代謝產物大多表現出趨于正常水平的變化趨勢，它們主要包括5-羥基-6-甲氧基吲哚葡糖苷酸、磷脂酰甘油、磷脂酰絲氨酸、乙酰半胱氨酸、2，8-二羥基喹啉-β-d-葡萄糖醛酸苷、N-果糖基蒜氨酸和膽紅素等，篩選出的這16個差異代謝產物也可以作為AAD的潛在生物標志物。

圖2 小鼠血清在正離子模式(1)和負離子模式(2)下的總離子流圖

圖3 乳酸菌素片對AAD小鼠干預前后血清代謝物的模式判別圖

表1 血清中差異代謝物的篩選

表2 基于UHPLC-MS的潛在差異代謝物鑒定

（續表2）

2.5 代謝通路分析

利用MetaboAnalyst軟件對16個差異性代謝物進行代謝通路分析，使用KEGG數據庫，將Impact≥0.001作為潛在的關鍵代謝通路，如表3、圖4所示，共得到6條代謝通路與乳酸菌素片緩解腹瀉癥狀密切相關，分別為半胱氨酸和蛋氨酸代謝、硫代謝、甘油磷脂代謝、戊糖和葡萄糖醛酸酯的相互轉化、卟啉和葉綠素代謝和谷胱甘肽代謝。與我們的研究結果一致，前期一項關于白頭翁湯治療濕熱腹瀉的代謝組學結果發現，差異代謝物主要參與戊糖和葡萄糖醛酸的轉化、甘油磷脂代謝和色氨酸的代謝等[13]。甘油磷脂作為哺乳動物細胞膜上的主要結構脂類，調節運輸和信號轉導，調節蛋白質功能。磷脂酰甘油(Phosphatidylglycerol,PG)參與生物膜特別是類囊體膜的構建，通過與蛋白的相互作用，調節各種代謝活動[14]。磷酯酰絲氨酸(Phosphatidylserine,PS)作為一種廣泛用于國內外的營養補充劑，具有改善記憶和認知、緩解精神壓力等作用[15]。在我們的研究中，模型組的PG和PS顯著升高，而乳酸菌素片治療后降低了PG和PS含量。因此，乳酸菌素片治療腹瀉與甘油磷脂代謝有關，但是乳酸菌素片治療后PG和PS含量的降低可能是由于調節甘油磷脂代謝通路中，PG和PS部分的通路因子差異或者腹瀉本身的模型差異造成，后期需要深入研究。同時，模型組小鼠體內葡萄糖醛酸苷水平顯著降低，乳酸菌素片治療后顯著增加了葡萄糖醛酸苷的水平，其屬于戊糖和葡萄糖醛酸酯的相互轉化，與碳水化合物的代謝有關[13]。此外，腸道氨基酸代謝具有重要的生理和營養功能，包括提供能量、維持腸黏膜細胞的數量及其吸收、防御、細菌屏障和免疫功能等[16]。與模型組相比，乳酸菌素片給藥后，乙酰半胱氨酸含量顯著升高，表明乳酸菌素片激活了半胱氨酸和蛋氨酸代謝途徑，增加了蛋氨酸的消耗，使其更多的用于半胱氨酸的生成途徑，進而增強機體的抗氧化能力，改善腸道功能。因此，我們推測乳酸菌素片治療腹瀉的機制可能與調節碳水化合物代謝、甘油磷脂代謝和氨基酸代謝等有關。

表3 代謝通路信息

圖4 差異代謝物代謝通路分析

3 結論

綜上所述，乳酸菌素片對腹瀉的改善作用明顯，主要可能與半胱氨酸和蛋氨酸代謝、甘油磷脂代謝、戊糖和葡萄糖醛酸酯的相互轉化等代謝途徑有關。本研究結果為后續進一步探討乳酸菌素片治療腹瀉的作用機制提供了理論依據和研究思路。