新型磷霉素殼寡糖鹽的抑菌活性研究

姜志煒，韓新才*，祝 宏，劉 慧，史凱麗，李睿媛，馬 峻

1.武漢工程大學環境生態與生物工程學院，湖北 武漢 430205；

2.武漢工程大學化工與制藥學院，湖北 武漢 430205；

3.武漢市金銀潭醫院，湖北 武漢 430023

磷霉素（fosfomycin，通常指左旋磷霉素）是一種在臨床上常用的重要廣譜抗生素［1］，它具有獨特的殺菌作用，能抑制細菌細胞壁的合成［2］，進而達到殺死細菌的目的，且不易產生耐藥性，臨床上具有廣泛的應用［3］。由于磷霉素對細胞壁合成的破壞，可以使其他藥物進入到細菌體內，進而產生協同作用［4］，且磷霉素具有良好的口服生物利用度，低毒、安全，具有較好的承受性［5-6］。殼寡糖（chitosan oligosaccharide）主要來源于甲殼素［7-8］，是公認的低分子量水溶性殼聚糖，其生物活性高于殼聚糖，具備帶正電荷、呈堿性、易溶于水［9］等特點，能抗菌、抗腫瘤［10］等，具有優越的生物活性［11］。它的化學結構與磷霉素呈現互補特征，二者的相互結合，在抵抗感染方面能夠具有一定的協同效應。通過在磷霉素的合成工藝上進行優化，進而制備出新型磷霉素-殼寡糖鹽（fosfomycin chitosan oligosaccharide salt，FCOS），可以為磷霉素家族增添新的成員。磷霉素殼寡糖鹽于磷霉素類抗菌藥而言，具有重要的研究意義，應對當下臨床上的“超級細菌”，磷霉素殼寡糖鹽具有很大的潛力。另外，區別于市面上現有的磷霉素鹽，磷霉素殼寡糖鹽可以作為一種新的藥物，具有較好的開發應用前景。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

SW-CJ-1FD 單人單面凈化工作臺（蘇州凈化設備有限公司）；DNP-9082 電熱恒溫培養箱（上海精宏實驗設備有限公司）；YXQ-SG41-280-A 手提式壓力蒸汽滅菌器（上海華線醫用核子儀器有限公司）；THZ-C 恒溫振蕩器（太倉市實驗設備廠）；

磷霉素殼寡糖鹽（實驗室自制）；磷霉素鈣（國藥集團化學試劑有限公司，批號：20180718），牛肉浸膏（生物試劑，上海博微生物科技有限公司，批號：190514）；蛋白胨（生物試劑，北京奧博星生物技術有限責任公司，批號：20191116）；硫酸H2SO4（分析純，西隴科學股份有限公司，批號：170810）；氯化鈉（分析純，國藥集團化學試劑有限公司，批號：20170608）；氯化鋇（分析純，國藥集團化學試劑有限公司，批號：20180615）；蒸餾水。

1.2 實驗菌株

大腸桿菌ATCC35218（Escherichia coli）、肺炎克雷伯菌ATCC700607（Κlebsiella Pneumoniae）、銅綠假單胞菌ATCC27853（Pseudomonas aeruginosa），由武漢市金銀潭醫院提供；耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（臨床分離株）（Methicillin-resistant Staphylococcus aureus）、沙 門 氏 菌CICC21482（Salmonella enteriditis），由武漢工程大學實驗室保存。

1.3 待測新型磷霉素鹽的理化性質

本實驗所使用的新型磷霉素殼寡糖鹽由武漢工程大學實驗室參照相關文獻［12-13］并做適當修改，化學合成的新型抗菌產品，其結構式如圖1 所示。由于提取終產物時的溶液pH 值各有不同，導致最終產品性狀有所差異，因此本實驗選擇新合成的5 批樣品進行病原菌抑菌作用測試，5 批產品性狀如表1 所示。

圖1 磷霉素殼寡糖鹽的結構式Fig.1 Structure of fosfomycin chitosan oligosaccharide salt

表1 五批樣品性狀Tab.1 Sample characteristics of five batches

1.4 方 法

以微量肉湯稀釋法測定新型磷霉素殼寡糖鹽對5 種病原菌的抑菌活性；在-20 ℃冰箱及常溫干燥器環境下保存7 d，再次以微量肉湯稀釋法測定抑菌活性，判斷保存條件對藥品的活性是否有影響。

1.4.1 藥品溶液的配制 取表1 所述5 批實驗室自制［14］新型磷霉素殼寡糖鹽樣品配制成1 mg/mL的藥品溶液；配制1 mg/mL 標準磷霉素鈣溶液，作為實驗藥品的對照組；制備麥氏比濁管，配制質量分數1%H2SO4溶液與質量分數1%BaCl2溶液，取0.1 mL H2SO4溶液與9.9 mL 質量分數1%BaCl2溶液，配制成1 麥氏濁度管，搖勻后取5 mL，加入5 mL 無菌水，制成0.5 麥氏比濁標準管，相當于1.5×108CFU/mL。

1.4.2 菌懸液制備 按照配方制備LB 液體培養基，稱取5 g 蛋白胨，1.5 g 牛肉膏，2.5 g 氯化鈉，置于燒杯中，加蒸餾水至500 mL，加熱溶解后分裝、滅菌，使用接種環分別從大腸桿菌、耐甲氧西林金黃色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、銅綠假單胞菌、沙門氏菌斜面上挑取3 環，分別接入100 mL 液體培養基中，充分振搖，于37 ℃、160 r/min 條件下搖床培養約5 h 左右，使其達到對數生長期［15］，作為實驗所用菌懸液。

1.4.3 最低抑菌濃度（MIC）值測定 將菌液稀釋成相當于0.5 麥氏比濁標準的溶液，再用液體培養基以1∶100 倍數進行稀釋，使含菌量數值達1.5*106CFU/mL；取無菌96孔板，于第一個孔加入100 μL 藥品溶液，第二個孔加入100 μL 藥品溶液和100 μL 液體培養基，依次倍比稀釋，最后在每個孔加入80 μL 液體培養基及20 μL 菌懸液，使藥品質量濃度梯度依次為，500、250、125、62.5、31.3、15.6、7.8、3.9 μg/mL；在其后一孔加入共180 μL 液體培養基和20 μL 菌液，作為細菌生長組對照，最后一孔加入200 μL 液體培養基，作為培養基對照組，測量藥品對5 種細菌的MIC 值，以文獻記述方法［16］判定最低抑菌濃度：若細菌生長組呈渾濁狀，培養基對照組呈清澈透明狀，則表明藥品溶液及培養基未受到污染，以梯度藥物組中從低到高依次排列的第一個清澈透明孔中的藥品濃度為最低抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）值。本試驗同時做3 組，取平均值作為最終MIC值。MIC 值越低，說明藥品抑菌活性越強。

1.4.4 保存條件對藥品抑菌活性的影響 將藥品配制成1 mg/mL 的溶液進行上述MIC 測定；分別放置于-20 ℃冰箱及常溫干燥器中，保存7 d 后再次測定其MIC 值；選取第一次實驗結果中藥品抑制效果較好的菌種作為試驗菌，試驗條件均相同，通過測量其最低抑菌濃度判斷其抑菌效果是否受到影響。

2 結果與討論

2.1 新型磷霉素殼寡糖鹽對5 種病原菌的最低抑菌濃度（MIC）的測定結果

新型磷霉素殼寡糖鹽5 批樣品對5 種病原細菌的MIC 測定結果見表2，從表2 可知，5 批樣品均具有抑菌活性，其中對耐甲氧西林金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌兩種細菌的抑菌效果都比較好，為3.9～15.6 μg/mL，效果明顯比磷霉素鈣的62.5 μg/mL 要低得多，說明本藥品對這兩種細菌的抑制效果較強；5 批樣品對肺炎克雷伯菌的效果也較好，為15.6～52.1 μg/mL，但相比較磷霉素鈣的62.5 μg/mL來說，抑菌效果的提升不高，僅FCOS-2、FCOS-3、FCOS-4 樣品效果比較好，為15.6 μg/mL；5 批樣品對沙門氏菌的抑菌效果和磷霉素鈣持平，均為104.2～125 μg/mL，與磷霉素鈣的抑菌效果無明顯差別；5 批樣品對大腸桿菌的抑菌效果不穩定，為15.6～104.2 μg/mL，FCOS-3 和FCOS-4 樣品對大腸桿菌的抑菌效果比磷霉素鈣好（15.6 μg/mL）FCOS-1、FCOS-2 和FCOS-5 的抑菌效果則比磷霉素鈣的31.3 μg/mL 要低，說明本樣品還有改進的空間。綜合來看FCOS-3 和FCOS-4 兩批藥品的抑菌效果最好，在后續的制備中可以參照這兩次的合成方法進行合成。

表2 磷霉素殼寡糖鹽對5 種不同病原菌的最低抑菌質量濃度Tab.2 MICs of fosfomycin chitosan oligosaccharide salt against five different pathogens

2.2 新型磷霉素殼寡糖鹽保存條件對病原細菌抑菌活性的影響

由上述實驗可知5 批樣品對Pae 和MRSA 的抑菌效果都比較好，且Pae 本身具有能夠顯色的特性，生長過程中可以使培養液變為綠色，利于觀察；用同樣效果較好的MRSA 對藥品進行對照實驗，利于對結果進行分析，由此選用Pae 和MRSA作為保存條件試驗的試用菌，保存條件對磷霉素殼寡糖鹽的抑菌活性影響結果見表3 和表4。由表可知，本藥品在低溫保存時穩定性較高，前后效果無明顯差別，MIC 值為3.9～15.6 μg/mL，但將其置于干燥器中常溫保存，效果出現顯著降低，MIC值為125～250 μg/mL，說明該藥品在常溫、干燥條件下抑菌活性容易流失，這可能是由于這種條件下有效結構發生降解，從而影響藥品的抑菌活性，因此在后續的藥品貯存中應盡量在低溫環境下進行保存，避免將藥品放在常溫干燥條件下。

表3 磷霉素殼寡糖鹽對銅綠假單胞菌的最低抑菌質量濃度Tab.3 MICs of fosfomycin chitosan oligosaccharide salt against Pae μg/mL

表4 磷霉素殼寡糖鹽對耐甲氧西林金黃色葡萄球菌的最低抑菌質量濃度Tab.4 MICs of fosfomycin chitosan oligosaccharide salt against MRSA μg/mL

3 結 論

本文對實驗室自制的5 批新型磷霉素殼寡糖鹽樣品進行了MIC 測定，測試了對Eco、MRSA、Pae、Kpn 和Sal 五種菌株的抗菌性能，并對保存條件對藥品抑菌活性的影響進行研究，相比磷霉素鈣而言，5 批磷霉素殼寡糖鹽樣品都對Kpn、MRSA和Pae 有較強的抑菌效果，尤其是針對MRSA 和Pae病原細菌，MIC 值均小于或等于15.6 μg/mL，顯著低于對照藥品磷霉素鈣的MIC 值62.5 μg/mL，說明本藥品對這兩種菌有較強的抑制作用，尤其是FCOS-3、FCOS-4、FCOS-5 3 批樣品對Pae 的抑菌效果為本次實驗的最低濃度梯度，說明其具有更強的抑菌潛力，但本藥品對Kpn 的抑菌效果較為不穩定，說明還有進行深入研究的必要；5 批藥品對Sal 的抑菌效果和磷霉素鈣基本持平，沒有特別明顯的差異，FCOS-1、FCOS-2、FCOS-5 3 批藥品對大腸桿菌的抑制效果低于磷霉素鈣，且FCOS-5的抑菌效果明顯較弱，這可能是由于沙門氏菌及大腸桿菌有特別的耐藥機制［17-18］，使細菌對本藥品具有耐藥性，因此針對這兩種細菌需要更深入的研究。

本批次藥品的保存條件對藥品的抑菌活性有較大的影響，在-20 ℃冷藏保存條件下效果穩定，但置于常溫干燥環境下抑菌效果會大幅下降，因此需要在低溫環境進行貯存。5 批新型磷霉素殼寡糖鹽對所選菌株均具有抑菌活性，且對于部分臨床常見菌的效果如Pae 和MRSA 明顯比現有藥品磷霉素鈣好，具有較好的開發前景。

與傳統抗菌劑抗生素相比較，磷霉素殼寡糖鹽具有較強的抑菌性能，但本藥品的合成工藝目前較為不穩定，根據合成條件的不同，得到的產品性能差異較大，需要對每一批次藥品做抗菌研究，因此對生產工藝需要進一步的研究。總體來看，磷霉素殼寡糖鹽的水溶性和抗菌活性良好，在抗菌領域中具有較大的潛在應用價值，本文為開發具有高效、低毒的新型磷霉素殼寡糖鹽藥物提供了實驗基礎。