鴨疫里默氏桿菌外膜蛋白A原核表達及間接ELISA方法的建立和初步應用

陳汝佳，李 婷，余 波，張亞楠，蒲 齡，歐德淵，徐景峨*

(1.貴州大學動物科學學院，貴陽 550025;2.貴州省農科院畜牧獸醫研究所，貴陽 550005)

鴨疫里默氏桿菌(Riemerellaanatipestifer，RA)是具有莢膜，未產生芽孢，沒有鞭毛的革蘭氏陰性短小桿菌[1]。目前暫定為里氏桿菌屬，未定為哪一科，純培養菌落涂片可見菌體呈單個、成對或偶呈絲狀，菌體大小不一，0.2～0.4 μm×1～5 μm[2]。RA在全國各地廣泛分布，且在鴨、鵝中具有著高感染率，主要通過呼吸道和損傷皮膚等傳播，也可經蛋垂直傳播[3]。該病一年四季皆可發生，其主要病變特征為纖維素性心包炎，纖維素性肝周炎和腦膜炎等多系統性綜合征[4]，在臨床上RA與鴨圓環病毒、鴨坦布蘇病毒、鴨源呼腸孤病毒、新城疫病毒等發生混合感染，給水禽業帶來嚴重危害[5]。

鴨疫里默氏桿菌外膜蛋白A(Outer Membrane Protein A，OmpA)具有較強的免疫原性和反應原性，不同來源的OmpA基因同源性較高。OmpA蛋白是RA的主要外膜蛋白維持細菌完整，同時參于吸附定植于宿主細胞[6]。此外，有研究已證明[7]，OmpA蛋白是RA的主要免疫原性蛋白。本研究利用原核表達系統成功制備了重組OmpA蛋白，并進一步建立了檢測RA IgG抗體的間接ELISA方法。

1 材料與方法

1.1 試驗材料 RA分離株(G06株)由本實驗室分離并保存；RA陽性及陰性血清、多殺性巴氏桿菌、沙門氏菌、坦布蘇病毒、大腸桿菌陽性血清由本實驗室保存；pET32a原核表達載體購自南京鐘鼎生物技術有限公司；BamHI、XhoI、BL21購自寶生物工程(大連)有限公司；DNA 膠回收試劑盒、質粒小量提取試劑盒購自OMEGA；IPTG、Urea購自生工生物工程(上海)股份有限公司；Tris、Glycine、SDS、酶標板、TMB顯色液、PBST購自北京索萊寶科技有限公司；HisPurTMNi-NTA純化試劑盒購自賽默飛世爾科技(中國)有限公司；HRP-羊抗鴨IgG購自美國KPL公司。鴨傳染性漿膜炎二價滅活疫苗(1型RAf63株+2型RAf34株)購自天津瑞普生物技術股份有限公司。

1.2 引物設計及合成 根據RA毒株中OmpA基因序列和pET32a原核表達載體載體序列中的克隆位點，利用Primer5.0設計一對特異性引物。選用BamHI和XhoI作為酶切位點，引物由上海生工公司合成，上游引物：5′-GGATCCATGTTGATGACTGGACTTGGT-3′，下劃線為BamHⅠ酶識別位點;下游引物: 5′-CTCGAGTTATTTTCTTTTCTTTTTTACTACT-3′，下劃線為XhoI酶識別位點；目的片段大小約為1149 bp。

1.3 pET32a-OmpA原核表達質粒的構建 提取RA總核酸，PCR擴增OmpA基因，利用BamHI和XhoI限制性內切酶雙酶切PCR產物同時雙酶切pET32a原核表達載體，將獲得的線性化目的基因與目標載體連接，連接產物轉化E.coliBL21(DE3)感受態細胞，挑取單個菌落，抽提質粒，雙酶鑒定和測序驗證。將測序結果與預期序列進行比對，驗證正確的質粒命名為pET32a-OmpA。

1.4 OmpA重組蛋白的誘導表達與純化 將pET32a-OmpA載體轉化至大腸桿菌BL21(DE3)感受態細胞，挑取轉化平板上的單個菌體擴大培養。用IPTG誘導表達重組菌37 ℃，4 h；取1 mL菌液，10000 g室溫離心2 min棄掉上清，用PBS重懸菌體，上樣。剩余菌液4000 g離心，10 min，棄上清，PBS重懸后超聲波破碎，分別取上清和沉淀，上樣。

1.4.1 OmpA重組蛋白可溶性分析 取陽性菌培養18 h，按1∶100接種50 mL LB(Amp+)錐形瓶，37 ℃搖到OD600值約為0.6，加終濃度0.5 mmol/L的IPTG誘導表達4 h，離心5 min，沉淀用PBS洗三遍，加20 mL PBS重懸，超聲破碎后4 ℃離心，收集包涵體。

1.4.2 OmpA蛋白的純化 包涵體使用Tris緩沖液洗滌3次后，用含2 mol/L尿素的Tris緩沖液洗去雜蛋白，離心取沉淀用含8 mol/L尿素的TGE緩沖液于4 ℃過夜溶解，離心取上清置于透析袋中，分別用6、5、4、3、2 mol/L尿素的TGE復性溶液梯次復性，蔗糖濃縮。

1.4.3 OmpA蛋白再純化 將蛋白質提取物與平衡緩沖液混合制備樣品使得總體積等于二倍樹脂體積；將HisPurNi-NTA旋轉柱700 g離心 2 min，去除存儲緩沖液；向平衡柱中加入二倍樹脂床體積的平衡緩沖液。使得緩沖液進入樹脂層700 g離心2 min，收集緩沖液；將制備好的蛋白提取物加入柱中，使其吸附于樹脂床700 g離心2 min；用二倍樹脂床體積的洗滌緩沖液清洗樹脂，700 g離心2 min，收集離心液；重復以上步驟兩次。上樣12%SDS-PAGE。

1.5 OmpA重組蛋白的Western-blotting鑒定 將純化后的重組OmpA蛋白上樣經SDS-PAGE后轉印至NC膜，5%脫脂粉封閉液封閉37 ℃1 h。用封閉液稀釋一抗(RA鴨陽性血清)，膜在一抗稀釋液中 4 ℃過夜。次日將膜取出后用PBST洗膜4次，每次5 min，用封閉液稀釋二抗(HRP-羊抗鴨IgG)。膜在二抗中37 ℃反應 1 h。反應完畢后，把膜取出后置于干凈的盒子中洗膜4次，每次5 min。ECL顯影，曝光。

1.6 OmpA間接ELISA檢測方法的初步建立 根據文獻[8]設計好包被板，在板條上做上標記。用包被液將OmpA蛋白抗原稀釋成需要的濃度，混勻后加入板中，每孔加入100 μL，4 ℃冰箱12 h。包被好后，棄除包被液，洗板3次，每孔加入200 μL 5%BSA封閉液，37 ℃恒溫孵育1 h。取出酶標板，棄除封閉液，洗板1次。RA陽性血清1∶100倍稀釋，每孔100 μL，37 ℃恒溫孵育1 h。取出酶標板，棄去內液，洗板3次，向每孔中加入100 μL 稀釋好的酶標二抗：HRP-羊抗鴨，1∶1000。37 ℃恒溫孵育1 h。取出酶標板，棄去二抗，洗板5次，每孔先加入200 μL TMB 顯色液，室溫15 min。每孔加50 μL終止液，終止反應。即刻在酶標儀上讀OD450值。

1.6.1 OmpA間接ELISA檢測方法的優化 以純化的OmpA蛋白為抗原，羊抗鴨-HRP為二抗，對下列條件進行優化，抗原包被濃度(1∶5、1∶10、1∶50、1∶100、1∶200、1∶400)、封閉條件(37 ℃ 15 min、37 ℃ 30 min、37 ℃60 min、37 ℃ 90 min、37 ℃ 120 min)、血清反應條件(37 ℃ 15 min、37 ℃ 60 min、37 ℃90 min、37 ℃ 120 min)、酶標反應條件(37 ℃ 15 min、37 ℃ 60 min、36 ℃ 90 min、37 ℃120 min)、顯色時間(5 min、10 min、15 min、20 min)。

1.6.3 特異性試驗 利用優化后的條件對本試驗室保存的多殺性巴氏桿菌、沙門氏菌、葡萄球菌和大腸桿菌陽性血清進行檢測，并設立RA陰陽性血清對照，評估該方法的特異性。

1.6.4 重復性試驗 批內重復試驗：使用同一批次純化的OmpA蛋白包被酶標板，對6份臨床陽性血清樣品進行檢測，每個樣品重復3孔。

批間重復性試驗：使用3個批次純化的OmpA蛋白包被酶標板，檢測同樣的6份陽性血清樣品。計算批內和批間變異系數，以檢測其重復性。

1.6.5 敏感性試驗 將5份RA抗體陽性血清進行倍比稀釋(1∶50、1∶100、1∶200、1∶400、1∶800、1∶1600、1∶3200)，利用建立的 ELISA方法進行檢測、評價其敏感性。

1.6.6 臨床樣品的檢測 利用本研究建立的OmpA間接 ELISA方法對2020年-2021年在貴州地區采集的120份鴨、76份鵝血清進行檢測，計算RA抗體陽性率。

1.6.7 OmpA間接ELISA檢測方法的初步應用 將40只1日齡健康雛鴨隨機分成2組，20只/組。分別設A組為滅活疫苗組(0.2 mL)、B組為生理鹽水陰性對照組(0.2 mL)。對飼養至7日齡健康雛鴨分別采用皮下注射進行接種免疫(首免)，間隔1周(14日齡)后進行二次免疫。在首免(7 d采血)和二次免疫(14 d采血)后21 d、28 d、35 d、42 d、49 d、56 d，各組隨機采集10只雛鴨外周血樣本，分離血清，測定OD450值。

將40只健康產蛋鴨隨機分成2組，20只/組。分別設A組為滅活疫苗組(0.40 mL)、B組為生理鹽水陰性對照組(0.40 mL)。對產蛋鴨分別采用皮下注射進行接種免疫(首免)，隔上1周后對產蛋鴨進行二次免疫。收集免疫產蛋鴨0、1、2、3、4、5、6、7 w下的種蛋，每組10枚蛋，采用間接ELISA方法檢測卵黃抗體，測定OD450值。

2 結果與分析

2.1 OmpA基因的PCR擴增及重組質粒鑒定 OmpA擴增產物及雙酶切重組質粒pET32a-OmpA的電泳結果均與預期片段一致，表明重組質粒構建正確(圖1)。

M: DL10000 Marker；1:酶切前質粒；2: 酶切后質粒

2.2 OmpA重組蛋白的誘導表達與純化 原核表達質粒 pET32a-OmpA體外誘導表達后經12% SDS-PAGE 分析，結果顯示，在57 KD處有預期大小的目的條帶，目標蛋白主要在沉淀中，上清中無明顯條帶(圖2.1)，表明 OmpA重組蛋白主要以包涵體形式表達。進一步利用 His 標簽蛋白純化試劑盒對OmpA重組蛋白進行純化。將11 μg純化后的重組蛋白上樣12% SDS-PAGE，顯示，在57 KD處有明顯單一條帶(圖2.2)，表明OmpA蛋白純化效果較好。用BCA法測得的純化OmpA蛋白的濃度約為2.243 mg/mL。

M：蛋白分子質量標準 1：未誘導 2：誘導后 3：誘導破碎后上清 4：誘導破碎后沉淀 5：破碎后處理樣品 6：流出 7：洗脫

2.3 OmpA蛋白的Western-blot鑒定 用鴨疫里默氏桿菌抗體陽性血清鑒定純化的OmpA蛋白。Western-blotting結果顯示，在57 KD處有一條清晰帶(圖3)，表明重組OmpA單邊具有良好的反應原性。

M:蛋白質分子質量標準 1：純化后OmpA蛋白

2.4 OmpA-ELISA檢測條件的優化結果 經多次方陣檢測結果顯示，OmpA蛋白以2.243 mg/mL的濃度進行包被，血清以11∶100稀釋，抗原包被條件為4 ℃過夜、封閉條件為37 ℃ 120 min、血清反應時間為37 ℃ 60 min、酶標抗體工作濃度為1∶1000、酶標抗體反應時間為37 ℃ 60 min、顯色時間為15 min。

圖4 臨界值的計算

2.6 特異性試驗 利用建立的OmpA-ELISA方法對本實驗室保存的多殺性巴氏桿菌、沙門氏菌、葡萄球菌和大腸桿菌陽性血清進行檢測，并設立RA陰陽性血清對照，結果顯示，除RA陽性血清有較好反應外，對其他血清均無明顯反應，說明該ELISA方法對RA特異性較好。

2.7 重復性試驗 選擇同批次包被ELISA板，進行批內重復試驗和批間重復試驗，結果顯示，批內變異系數2.77%～8.00%，批間變異系數為1.10%～7.80%，變異系數均小于10%，證明該ELISA方法可重復。

表1 特異性試驗

表2 重復性試驗

2.8 敏感性試驗 運用建立的OmpA-ELISA方法將RA陽性血清稀釋7個梯度后，結果顯示當陽性血清稀釋比例為1∶1600時，OD450值仍大于0.389(圖5)，仍可判斷為陽性，表明該方法敏感性較高。

圖5 敏感性試驗

2.9 臨床樣品的檢測 利用試驗建立的OmpA-ELISA方法對貴州省120份鴨、76份鵝血清樣本進行檢測，結果顯示，120份鴨血清樣本中57份血清樣本為陽性，63份血清樣本為陰性，陽性率為47.5%。76份鵝血清樣本中17份血清樣本為陽性，59份血清樣本為陰性，陽性率為22.4%。

2.10 OmpA間接ELISA檢測方法的初步應用 應用本試驗建立的OmpA-ELISA方法檢測經滅活疫苗免疫后雛鴨RA抗體及免疫產蛋鴨后鴨蛋中卵黃抗體規律變化水平。如圖6、圖7所示。

圖6 雛鴨血清中RA特異性抗體檢測

圖7 鴨蛋卵黃中RA特異性抗體檢測

3 討論與結論

RA病是目前危害水禽養殖產業最主要的細菌源傳染病之一，RA傳播性和致病性強，患病鴨感染后死亡率高、生長緩慢且治療難度增大，對水禽養殖產業打擊巨大[9]。使用抗生素是治療該病的主要措施，而濫用抗生素致使RA易產生多重耐藥，甚至造成藥物殘留，嚴重危害環境和人類健康[10]。出于對耐藥性和食品安全性等問題的考慮，采用疫苗免疫預防該病仍是當前最為安全、有效的途徑[11]。因此，在臨床上檢測鴨群中RA抗體是有必要的，通過抗體檢測可以判斷鴨場中RA抗體水平，從而制定有效的防控措施。間接ELISA方法是檢測RA抗體的重要手段，但由于目前商品化的試劑盒多以裂解菌體或脂多糖作為抗原，而血清中存在較多針對血清型相關的特異性抗體，血清型針對性較強，使檢測結果易出現假陰性或假陽性[12]。實驗室前期使用江蘇某公司鴨疫里氏桿菌(RA Ab)ELISA試劑盒檢測滅活疫苗免疫鴨血清抗體，檢測結果均為陰性。因此，建立一種臨床檢測不同血清型RA抗體的間接ELISA方法非常有必要。

外膜蛋白A(OmpA)是細菌外膜蛋白的主要組成成分，在維持細菌結構的完整性、參與黏附侵襲宿主和逃逸宿主防御機制中發揮重要作用[13]。近年來研究表明OmpA是RA各血清型共有的外膜蛋白，并且具有很高的保守性與很強的抗原性[14]。余波[15]等基于鴨疫里默氏桿菌OmpA基因構建的真核表達質粒pVAX1-OmpA，通過免疫雛鴨后表明該質粒能夠誘導鴨機體產生RA特異性抗體，并且具有較強的免疫保護效果。Yang等[16]將鴨IgY Fc基因與RA的OmpA基因融合真核表達，并轉化畢赤酵母重組表達，免疫雛鴨后能夠顯著提高血清抗體滴度，具有良好的免疫效力、保護性及安全性。因此本研究構建了pET32a-OmpA的原核表達質粒，成功表達了OmpA重組蛋白，并以該蛋白為抗原初步建立ELISA方法，通過特異性、敏感性、重復性試驗表明本研究建立的間接ELISA方法特異性強，敏感性高，重復性好。應用本方法檢測2020年9月到2021年9月貴州省120份鴨血清樣本5中7份血清樣本為陽性，陽性率為47.5%。76份鵝血清樣本中17份血清樣本為陽性，陽性率為22.4%。應用該方法檢測滅活疫苗免疫后的鴨血清和卵黃抗體，結果符合滅活疫苗消長規律。

現今各養殖場面對RA的感染，均出現在對抗生素耐藥的情況，感染后很難治療[17]，因此預防和早期檢測對于RA的廣泛爆發具有重要作用，試驗研究結果表明，OmpA蛋白間接ELISA檢測RA抗體效果明顯，對無抗養殖技術的推廣普及提供了強有力支持。