洗腿又方治療骨關節炎的網絡藥理學研究*

張婷 曾建偉 陳俊 戴雨婷 鄭若曦 吳廣文,2#

（1福建中醫藥大學中西醫結合研究院 福州 350122；2福建中醫藥大學中西醫結合學院 福州 350122；3福建省中西醫結合老年性疾病重點實驗室 福州 350122）

骨關節炎（Osteoarthritis, OA）是常見的慢性退行性骨關節病，患病率與人口老齡化和肥胖率呈正相關，在中國60歲以上人群中OA發病率更是高達42.8%[1]。OA的病因是多因素的，包括遺傳和環境因素。它的主要特點是關節軟骨退化，主要表現為膝關節及其鄰近組織出現退行性改變[2]。常見的臨床表現為關節腫脹、劇痛、僵硬、畸形和不同程度的活動受限等[3]。這與中醫學的“痹證”表現類似，系由于風寒濕邪所致，患者出現肢體疼痛或功能障礙等主要癥狀，多見于50歲左右患者。現代醫學對該病的治療，晚期采用人工關節置換術，早中期主要根據癥狀進行相應治療，雖可暫時緩解癥狀，但長期應用非甾體類抗炎藥胃腸道反應較頻繁，容易復發[4~5]，且不能徹底治愈OA[6~7]。因而挖掘新的治療方法迫在眉睫。洗腿又方，出自清宮《慈禧光緒醫方選議·光緒皇帝四肢病醫方》，組方為酒歸尾、青風藤、宣木瓜、赤芍、透骨草各9 g，防風4.5 g，水煎，熏洗患膝關節[8]，經臨床檢驗治療效果顯著，由于其是熏洗的給藥方式，使其具有安全、穩定和高接受度等優點，但此方法對于患者而言仍不便捷。因此，如何有效利用現代生物技術來使中醫藥的臨床運用更加高效便捷是一個亟待解決的問題。本研究利用生物信息學、網絡藥理學和分子對接技術等方法，探索該方的潛在治療靶點和信號通路，以期為OA的后續治療和高效便捷的新藥開發提供了方向和理論依據[9]。現報道如下：

1 資料與方法

1.1 篩選骨關節炎的差異表達基因在GEO（Gene Expression Omnibus, GEO, https://www.ncbi.nlm.nih.）檢索“Osteoarthritis”篩選獲得GSE82107芯片數據和其基因注釋文件GPL570。共17份滑膜組織活檢樣本，其中10份為OA患者滑膜組織活檢樣本，剩余7份為健康滑膜組織活檢樣本。運用R語言中的多陣列平均分析算法進行背景校正，再將基質數據歸一化處理。通過Limma包分析差異基因表達，篩選條件設為P＜0.05，差異倍數（Foldchange, FC）＞2。最后利用GGplot2包生成差異表達基因的原始火山圖和熱圖。

1.2 洗腿又方中的中藥活性成分及相應靶點的獲取采 用 TCMSP（https://tcmsp-e.com/）、HERB（http://herb.ac.cn/） 和 TCMID （http://www.megabionet.org/tcmid/）數據庫搜集洗腿又方中各藥物的活性成分及其作用靶點，根據外用藥物經皮吸收的特點，設置篩選條件為：類藥性（Drug-likeneee, DL）≥0.18，分子量（Molecular Weight, MW）≤500，脂水分配系數對數值（AlogP）在1~3之間，獲得活性成分及其作用靶點，并通過蛋白質序列數據庫（UniportKB, https://www.uniprot.org/uniprot/）對靶點蛋白進行標準化注釋。

1.3 疾病與藥物交集靶點的獲取運用R語言中的Draw Venn Diagrams程序包處理1.1和1.2中獲取的疾病靶點和藥物靶點以獲取交集靶點，并導出Venny圖。

1.4 蛋白-蛋白相互作用（PPI）網絡的構建將洗腿又方治療OA的靶點導入Cytoscape 3.8.2軟件中，運 用 STRING、HPRO、BIND、DIP、MINT、INTACT和BIOGRID等數據庫對結果進行網絡拓撲分析，得到蛋白互作網絡。采用CytoNCA插件對以上結果進行拓撲學參數分析和篩選，篩選標準為用度中心性DC（為網絡中與靶點相關的靶點數量，DC值越高可認為與其相關的靶點數越多）大于2倍中位數，中介中心度BC（為經過一個靶點最短路徑的數量，BC值越高說明網絡中經過該靶點最短路徑的數量越多）大于1倍中位數，得到疾病相關靶點，最后采用CytoNCA根據網絡節點的拓撲屬性，篩選獲取關鍵靶點。

1.5 GO和KEGG通路富集分析及KEGG關系網絡的構建DAVID數據庫（https://david.ncifcrf.gov/）是生物數據庫，包括功能注釋、可視化和富集通路等功能。首先將關鍵靶點導入DAVID數據庫進行富集分析，再運用R語言的GGplot2程序包繪制GO分析條形圖和KEGG富集分析氣泡圖，其中氣泡越大代表信號通路中富集到更多基因。最后使用Cytoscape 3.8.2軟件制作KEGG關系網絡。

1.6 分子對接首先從Pubchem數據庫（http://zinc.docking.org/）獲取1.4中關鍵活性成分的結構，并用ChemBio3D軟件優化結構，以mol2格式保存。在PDB數據庫（https://www.rcsb.org/）下載目標蛋白的PDB格式文件，并用PyMol軟件優化結構。然后通過Autodock Tools獲取活動站點的中心和框的大小等對接信息。運用Autodock-vina1.1.2進行分子對接計算，最后使用PyMol軟件對活性成分和目標蛋白的對接結果進行可視化展示。

2 結果

2.1 OA的差異基因芯片GSE82107原始數據文件包括17份滑膜活組織樣本，通過R語言將其中10份OA患者的滑膜活組織樣本與7份健康個體的滑膜活組織樣本進行比較分析。共得到2072個顯著改變和受影響的基因，包括1 191個上調節基因和881個下調節基因。并以火山圖和熱圖的形式展現。見圖1、圖2。

圖1 火山圖

圖2 熱圖

2.2 洗腿又方中的藥物活性成分依據DL≥0.18，MW≤500，AlogP在1~3之間，獲得候選活性成分，并結合文獻資料，最終確定活性成分。共篩選得洗腿又方中藥物的活性成分34個，其中赤芍9個，當歸2個，防風12個，木瓜2個，青風藤3個，透骨草6個。見表1。

表1 洗腿又方中藥物的活性成分

2.3 洗腿又方治療骨關節炎的有效成分-靶點網絡圖的構建應用R語言的Draw Venn Diagrams程序包獲取疾病與藥物的交集靶點30個，并導出Venn圖。見圖3。通過對TCMSP數據庫中目標預測模型的配對分析，獲得有相應靶點的20個有效成分。然后用Cystoscape 3.8.2構建洗腿又方治療骨關節炎的有效成分-靶點網絡圖。見圖4。

圖3 Venn圖

圖4 洗腿又方有效成分-靶點網絡圖

2.4 蛋白－蛋白相互作用（PPI）網絡圖的構建將洗腿又方治療OA的靶點導入Cytoscape 3.8.2軟件中制作PPI圖，得到疾病相關靶點1 531個，靶點與靶點相互關系25 214個，再進一步采用CytoNCA根據網絡節點的拓撲屬性經DC值篩選后排除無關節點得到疾病相關靶點215個，靶點與靶點相互關系5 547個，最后經BC值篩選后得到關鍵靶點71個，靶點與靶點相互關系1 099個。見圖5。

圖5 PPI圖

2.5 GO和KEGG通路富集分析及KEGG關系網絡的構建在DAVID數據庫中進行GO和KEGG富集分析，其中GO生物過程（BP）分析結果主要富集在對氧水平降低的反應和對機械刺激的反應等方面。見圖6。GO分子功能（MF）分析結果主要表現在細胞因子活性、泛素樣蛋白連接酶結合活性和受體-配體活性等方面。見圖7。GO細胞組分（CC）分析結果主要涉及細胞器外膜、細胞外膜和線粒體外膜等方面。見圖8。KEGG富集分析結果主要涉及P53信號通路、白細胞介素-17信號通路和內分泌抵抗等信號通路。見圖9、圖10。

圖6 洗腿又方治療OA的基因本體論數據庫生物過程分析圖

圖7 洗腿又方治療OA的基因本體論數據庫分子功能分析圖

圖8 洗腿又方治療OA的基因本體論數據庫細胞組分分析圖

圖9 洗腿又方治療OA的關聯信號通路分析圖

圖10 KEGG關系網絡圖

2.6 分子對接分析根據洗腿又方活性成分-靶點網絡圖與蛋白互作中的Degree值，選取關鍵活性成分芹黃素（apigenin）與關鍵靶點HIF1A、關鍵活性成分槲皮素（quercetin）與關鍵靶點CASP8，進行分子對接。結果表明，兩種活性成分與目標受體蛋白的結合能均小于-5 kJ/mol，表明2種分子與目標受體結合良好。見圖11、圖12。

圖11 芹黃素（apigenin）-HIF1A

圖12 槲皮素（quercetin）-CASP8

3 討論

目前，臨床治療OA的常用藥物有非甾體類抗炎藥、止痛藥（阿片類藥物和非阿片類藥物）、對癥慢效藥物以及局部給藥制劑，而外用藥物的使用最大程度避免了口服藥所帶來的一系列不良反應，如減少了胃腸道不適和心血管方面不良事件[10]。但此類藥物依然只能暫時緩解癥狀，未能完全治愈疾病[11]。因此，如何提高療效成為臨床研究中亟待解決的問題。目前西醫對晚期OA尚無特效藥物。中草藥因其療效顯著、不良反應少等優點，在OA治療中的優勢日益凸顯。

洗腿又方出自清宮，療效顯著，共六味藥。酒歸尾，性溫味甘，能活血化瘀，加以酒制，助其辛散，更能發揮其效；木瓜性溫味酸，舒筋通絡；赤芍性酸味苦，能斂陰止痛，并能化瘀；青風藤、透骨草均能祛風濕以利關節，且入肝腎兩經，可為引經藥；防風性微溫味辛、甘，可祛風通絡。OA，中醫之“痹癥”，乃血虛風濕入絡所致，故選用祛風濕藥木瓜、青風藤、透骨草、防風以祛風除濕、通利經絡，更兼當歸、赤芍補血活血，標本兼治，且其為外用熏洗藥，經皮吸收，可使藥物直達病所。經臨床實踐檢驗，療效顯著，具有安全穩定和接受度高等優勢[12]。

本研究基于網絡藥理學的方法篩選獲得洗腿又方的活性成分，其中芹黃素、槲皮素、漢黃芩素、黃芩素等為洗腿又方治療OA的關鍵活性成分。芹黃素是一種具有多種藥理特性的天然黃酮，有抗炎、抗氧化、保護軟骨和抗腫瘤等作用。研究發現芹黃素可使IL-1β顯著降低，還可以使SOX-9、膠原蛋白2琢1和蛋白聚糖的表達水平增加，可減輕氧化應激、抑制炎癥和促進細胞外基質成分產生以預防OA[13~14]。還有研究表明芹黃素以濃度依賴的方式完全阻斷IL-1β誘導JNK磷酸化和NF-κB降解（代表Hif-2α表達的關鍵途徑），提示芹黃素可作為新型Hif-2α抑制劑治療OA[15]。槲皮素是一種典型的天然植物黃酮類化合物，具有抗炎、抗氧化、免疫調節和抑制關節滑膜組織增殖等多種生物活性，對減緩OA的病程有一定的作用。有研究表明槲皮素有26種與OA相關的靶蛋白，這些靶標主要集中在線粒體ATP合成，質子轉運以及一氧化氮的生物合成等過程中[16]。同時有研究表明槲皮素可顯著抑制基質降解蛋白酶和炎癥介質，減輕氧化應激、內質網應激和軟骨細胞凋亡從而發揮軟骨保護作用[17~18]。還有研究表明在槲皮素治療的OA大鼠中，TLR-4和NF-κB的表達以劑量依賴性方式被顯著抑制[19]。綜上所述，洗腿又方中的活性成分可通過抑制炎癥，抗氧化和保護軟骨基質發揮治療OA的作用。

根據DAVID對洗腿又方治療骨關節炎的HIF1A、CASP8、RAF1、APLN、RANKL、WISP1、IL-7等關鍵靶點的富集分析發現，洗腿又方通過干預炎癥、細胞周期和內分泌等通路發揮了治療OA的作用。在炎癥相關通路方面，IL-7刺激的IL-7R成熟B細胞發揮促炎作用[20]。OA的惡化與淺表和中層軟骨區的TLR免疫染色增加之間存在相關性[21]。在細胞周期相關通路方面：滑膜誘導的血管生成是OA發病機理的核心，APLN參與OA發病機理和血管生成[22]；可通過調節RANKL信號通路發揮對OA的治療作用[23]；WISP1可以通過調節OA中的αvβ3受體和PI3K/Akt信號通路來保護軟骨細胞的衰老和凋亡發揮治療OA的價值[24]。RAF1/MEK/ERK信號通路及其磷酸化參與OA軟骨細胞的增殖[25]。在內分泌相關通路方面：在OA成骨細胞中THRα敲低后，這些THR下游基因VEGF、HIF-1A和IGF-1被下調，提示局部抑制THRα可能是治療OA的潛在靶標[26]。已有研究證實通過shRNA介導的關節組織FSHR下調阻斷FSH信號能有效延緩OA的進展[27]。同時分子對接結果表明，芹黃素和槲皮素可能通過靶向調控HIF1A、CASP8等核心靶點抑制OA的進展。本研究通過生物信息學、網絡藥理學和分子對接等方法探討了洗腿又方治療OA的關鍵基因及分子機制，為OA的潛在治療靶點提供了新參考，為其機制尋求新突破點，也為中藥開發指明了新思路與方向。