基于線粒體16S r RNA和COI序列的江蘇啟東海域4種貝類遺傳多樣性分析

閆永斌，葛玉雙，程起群，范瑞良，李楠楠，全為民

（1.中國水產科學研究院東海水產研究所，上海 200090；2.上海海洋大學海洋科學學院，上海 201306）

貝類的種類極為豐富，具有重要的經濟和生態價值，在漁業產業和生態修復中占有極為重要的地位。據統計，2017年貝類產量超過1 500萬t，占水產品總量的23.7%［1］。日本鏡蛤（Dosinia japonica）、四角蛤蜊（Mactra veneriformis）、西施舌（Coelomactra antiquata）、中 國 蛤 蜊（Mactra chinensis）隸屬于軟體動物門（Mollusca），雙殼綱（Bivalvia），簾蛤目（Veneroida），主要分布在中國、韓國、朝鮮、日本以及俄羅斯遠東海域，且分布區多有重疊［2-5］，這4種貝類都具有較高的營養價值和經濟價值，尤以西施舌為貴。受過度捕撈等因素的影響，這4種貝類的野生種群狀況堪憂：日本鏡蛤和西施舌的資源量不斷減少，呈現不斷衰減的趨勢；四角蛤蜊的產量也逐年下降［2，4］；中國蛤蜊由于野生種群的生存受到威脅，而養殖的蛤蜊幼苗依舊需要靠野外采捕得到，因此苗種的稀少也阻礙了中國蛤蜊增養殖業的發展［4］。除了經濟價值外，貝類的生態價值也極其重要。貝類可通過降低水體中顆粒有機物（藻類和有機碎屑）的濃度，間接控制氮磷營養鹽濃度，耦合水層-底棲環境，保護生物多樣性和營造生物生境，并且承擔了生態系統中的部分固碳功能，在水體生態系統修復中起到重要的作用［6-8］。

遺傳多樣性是指同一物種不同種群間、同一群體不同個體間遺傳變異的總和，是物種和種群適應環境變化的重要物質基礎，是生物多樣性的重要組成部分［9-10］。貝類的遺傳多樣性，不僅反映其本身的資源狀況，還會對水域生態系統結構和功能的變化產生影響。因此，開展貝類遺傳多樣性的調查研究，具有重要的意義。動物mtDNA具有母系遺傳、進化速度快、結構簡單、分子量小等特點，常被用于物種遺傳多樣性等領域的研究；其中的16SrRNA（16Sribosomal RNA）和COI（細胞色素氧化酶I亞基，cytochrome oxidase subunit I）基因是貝類遺傳多樣性領域中應用較廣的分子標記［4，9-10］。

有關日本鏡蛤、四角蛤蜊、西施舌和中國蛤蜊等4種貝類的研究，主要集中在生殖發育、繁殖生物學、生藥學、增養殖技術等方面［4，11-12］；染色體核型分析、重金屬積累、寄生蟲病、免疫等方面的研究也有若干報道［4，13］。而涉及遺傳多樣性的文獻較少，僅見國內有若干關于四角蛤蜊、西施舌和中國蛤蜊的研究［3-4，9-14］。本研究通過PCR擴增并測序啟東海域的日本鏡蛤、四角蛤蜊、西施舌和中國蛤蜊等4種貝類的16S rRNA和COI基因片段，調查分析其遺傳多樣性狀況，以期為啟東海域貝類種質資源的管理、保護和監測提供參考依據，進而為精準制定相關的管理和保護措施提供科學數據支撐。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

2019年8月6—14日，在江蘇省啟東海域（31°39.616′～32°08.474′N、121°44.742′～122°09.980′E）設置27個采樣點，以采集各種貝類樣本，其中包括日本鏡蛤、四角蛤蜊、中國蛤蜊和西施舌樣本共2 031只。樣本取回后，放置在-20℃冷凍保存備用。

1.2 基因組DNA的提取

從所采集的2 031只貝類樣本中，隨機選取日本鏡蛤、四角蛤蜊、中國蛤蜊和西施舌樣品各30只（以各物種中文名稱的首字母作為編號，分別編號為：R1～R30、S1～S30、Z1～Z30、X1～X30）。取閉殼肌組織；用海洋動物組織基因組DNA試劑盒（天根公司）提取基因組DNA，-20℃保存備用。提取步驟按照試劑盒說明書操作。

1.3 線粒體16Sr RNA和COI基因序列的PCR擴增與測序

分別用通用引物或自行設計的引物，對4種貝類的16SrRNA和COI基因進行PCR擴增，引物信息見表1。由于COI通用引物對西施舌樣本的擴增效果不佳，故西施舌COI標記的擴增引物需自行設計（在NCBI網站下載1條西施舌線粒體COI基因序列，序列號為FJ653656.1，然后基于該基因兩端的保守序列，利用軟件Primer Premier 6設計、優化西施舌的COI擴增引物），引物在上海生工生物技術服務有限公司合成。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequence

PCR反應總體積為25μL，包括Taq酶預混液12.5μL，正反引物各1μL，DNA模板3μL，雙蒸水7.5μL。PCR擴增程序見表2。

表2 PCR擴增程序Tab.2 PCR amplification program

PCR產物在1%瓊脂糖凝膠中電泳，溴化乙錠（ethidium bromide，EB）染色，凝膠成像系統檢測。擴增產物送至上海生工生物技術服務有限公司進行雙向測序，測序引物與PCR引物相同。

1.4 數據分析

通過ClustalX（Version1.83）［17］軟件進行多序列比對和分析，采用MEGA X［18］軟件確定各序列的堿基組成、多態位點及個體間遺傳距離等。采用DNASP v5.0［19］軟件計算單倍型個數（H），單倍型多樣性（Hd），核苷酸多樣性（Pi）和平均核苷酸差異數（k）等遺傳多樣性參數。

2 結果與分析

2.1 PCR擴增結果

日本鏡蛤、四角蛤蜊、中國蛤蜊和西施舌4種貝類的PCR擴增電泳圖見圖1。結果顯示，4種貝類均可擴增出與預期片段大小一致的目的片段。其中16SrRNA長度均約為300 bp；而COI標記由于采用的引物不同，擴增出的片段長度有差異，日本鏡蛤、四角蛤蜊和中國蛤蜊擴增長度均約為665 bp，而西施舌長度約為505 bp。

圖1 線粒體標記PCR擴增電泳圖Fig.1 PCR products of mtDNA genes

2.2 序列變異特征

絕大部分PCR產物測序結果良好，符合分析要求。最終用于分析的序列數分別為：1）16SrRNA基因標記：四角蛤蜊30條、中國蛤蜊30條、日本鏡蛤29條、西施舌29條；2）COI基因標記：四角蛤蜊28條、中國蛤蜊29條、日本鏡蛤30條、西施舌30條。平均堿基組成見表3。

由表3可知，4種貝類的16SrRNA和COI基因片段的堿基組成結構呈現出A＋T明顯高于C＋G、且C的比例都是最低的特點，而兩種基因片段不同之處在于堿基A和T比例的不同，在16SrRNA基因片段中A與T的比例相差不大，而在COI基因片段中T的比例明顯高于A的比例。

表3 4種貝類16S r RNA和COI基因片段序列平均堿基含量Tab.3 Average base composition of 16Sr RNA and COI gene fragments of four shellfishes （%）

2.3 4種貝類的遺傳多樣性分析

由表4可知，就16S rRNA而言，四角蛤蜊單倍型多樣性最高（Hd＝0.933），中國蛤蜊最低（Hd＝0.411），日本鏡蛤與西施舌相差不大；而西施舌核苷酸多樣性最高（Pi＝0.009 37），中國蛤蜊最低（Pi＝0.001 74），四角蛤蜊與日本鏡蛤相差不大。COI基因結果顯示，四角蛤蜊單倍型多樣性最高（Hd＝1.000），中國蛤蜊最低（Hd＝0.874），日本鏡蛤與西施舌相差不大；西施舌核苷酸多樣性最高（Pi＝0.013 47），中國蛤蜊最低（Pi＝0.003 49）。

表4 基于16S r RNA和COI基因片段的4種貝類遺傳多樣性分析Tab.4 Analysis of genetic diversity based on 16S r RNA and COI gene fragments

3 討論

國外已有學者對雙殼類mtDNA、16S rRNA及COI基因序列開展研究［20-21］。本研究擴增測定了日本鏡蛤、四角蛤蜊、中國蛤蜊和西施舌的16SrRNA及COI基因片段序列，分析了各個物種之間的差異以及同一物種不同標記之間的差異，初步得到了啟東海域4種貝類的遺傳多樣性本底信息，為該地區貝類資源管理、保護和監測工作提供基礎數據支撐。

3.1 堿基組成分析

有關無脊椎動物線粒體全基因組測序的報道均顯示，其基因序列堿基組成比例為A＋T＞G＋C。且對于16S rRNA基因，rRNA的生物學活性不僅依賴于DNA序列的一級結構，也依賴于二級甚至三級結構。rRNA基因的二級結構由多個大小不一的莖環組成，通過G-C、A-U甚至不太穩定的G-U配對來維持，其二級結構中的環富含A，而莖富含G，由于G-C之間氫鍵的作用力大于A-U和G-U，因此莖中富含G有利于維持其二級結構［22-23］。

本研究結果亦顯示，4種貝類16S rRNA和COI標記的堿基比例都是A＋T＞C＋G，這與無脊椎動物線粒體DNA堿基組成特點相符［3］。從16SrRNA標記看，堿基A與T的比例相差不大，但堿基G的比例大于C，該堿基比例與孟學平等［4］對西施舌、中國蛤蜊和四角蛤蜊的研究結果以及陳淑吟等［10］對西施舌的研究結果大致相似，符合rRNA堿基組成特點。從COI標記看，堿基T的比例大于A，堿基G的比例大于C。該堿基比例與朱立靜等［3］對四角蛤蜊的研究結果相似，與陳淑吟等［10］對西施舌的研究結果有一定差異，但總體比例相差不大，而與王帥［14］對西施舌長樂群體的研究結果差異較大，其結果顯示，西施舌COI基因A／G／C／T所占的比例分別為42.27%、15.32%、21.41%、21.00%，原因可能是西施舌長樂群體與其他群體遺傳分化距離較遠。

3.2 遺傳多樣性分析

遺傳多樣性不僅是形成生物多樣性的基礎，也是物種進化潛能的保證，核苷酸多樣性（Pi）表示每個群體內各個單倍型的兩兩配對差異的平均值，是衡量群體遺傳多樣性的一個重要指標［24］；兩個隨機群體選取的mtDNA序列間核苷酸多樣性值越小，群體的遺傳多樣性越低。核苷酸多樣性指數Pi值考慮了各種mtDNA單倍型在群體中所占的比例，能夠精確反映一個群體mtDNA的多態程度［25］。GRANT和BOWEN［26］根據單倍型多樣性（Hd）和核苷酸多樣性（Pi）兩者的關系將種群事件分為4種模式：第一類為Hd和Pi均低（Hd＜0.5，Pi＜0.005）；第二類為Hd高而Pi低；第三類為Hd低而Pi高；第四類為Hd和Pi均高。

本研究中，從16S rRNA基因來看，西施舌、四角蛤蜊和日本鏡蛤的單倍型多樣性水平較高（Hd＞0.5），核苷酸多樣性水平也較高（Pi＞0.005），屬于第四類情況，其遺傳多樣性處于一個較高的水平；而中國蛤蜊的單倍型多樣性水平（Hd＜0.5）和核苷酸多樣性水平（Pi＜0.005）均較低，屬于第一類情況，表明其最近發生了種群瓶頸效應或由單一、少數系群所發生的創立者效應（founder effect）。從COI基因來看，西施舌和四角蛤蜊的單倍型多樣性水平較高（Hd＞0.5），并且核苷酸多樣性水平也較高（Pi＞0.005），屬于第四類情況，其遺傳多樣性水平較高；而日本鏡蛤和中國蛤蜊的單倍型多樣性水平較高（Hd＞0.5）而核苷酸多樣性水平較低（Pi＜0.5），屬于第二類情況，可能是經歷了瓶頸效應后，種群的迅速生長和基因突變的積累導致的。

陳淑吟等［10］在2007年對西施舌啟東群體的16SrRNA和COI基因標記的遺傳多樣性進行了調查，其核苷酸多樣性指數Pi分別為0.005 49和0.009 22，均比本實驗結果低，其中16S rRNA基因標記可能是因為擴增所用的引物序列不同，導致結果有所差異，而COI基因標記提示西施舌啟東群體10多年后COI基因片段的變異程度有所提高，這可能由取樣位點的差異或取樣方法的不同導致，也可能是線粒體基因組遺傳變異的結果［12］。朱立靜等［3］從COI基因標記的角度對四角蛤蜊的南通群體和連云港群體的遺傳多樣性進行調查，結果顯示，其核苷酸多樣性指數分別為0.007 74和0.004 56，本實驗結果與其相差不大。王帥［14］從COI基因角度對西施舌山東群體和長樂群體的遺傳多樣性進行了分析，結果顯示，核苷酸多樣性指數分別為0.007 315±0.006 113，0.004 661±0.003 247，與本實驗相比，山東群體的四角蛤蜊遺傳多樣性水平更接近啟東群體，而長樂群體的遺傳多樣性水平較低。這可能是因為在地理分布上，啟東群體與山東群體的距離較近，而遺傳分化距離也較近，而與長樂群體的遺傳分化距離較遠。

3.3 貝類遺傳多樣性與生態系統功能之間的關系

生物多樣性與生態系統功能的關系是生態學研究的一個熱點，了解和掌握生物多樣性與生態系統功能的關系及其內在機制對于生物多樣性、生態系統保護及其合理利用意義重大。生物多樣性包括遺傳多樣性、物種多樣性和生態系統多樣性，遺傳多樣性是生物多樣性的重要組成部分，但目前研究多集中于物種多樣性與生態系統功能的關系上，有關遺傳多樣性與生態系統功能之間的關系研究僅局限于植物研究中［27］。

貝類的生態作用通常體現在水體生態中，可降低水體中顆粒有機物（藻類和有機碎屑）的濃度，間接控制氮磷營養鹽濃度，耦合水層—底棲環境，保護生物多樣性和營造生物生境，因此貝類是一種常用的水體生態修復治理生物，并且承擔了生態系統中一部分的固碳作用。貝類的生態修復功能多以貽貝（Mytilus edulis）和牡蠣科貝類為主體［6］，而簾蛤目貝類的生態作用主要為固碳效應，并且可以耦合水層—底棲環境。與森林的固碳作用相比，貝類所固定的碳在自然過程中不易釋放，能夠在較長的時間產生作用［28］，且據張繼紅等［7］對貝類固碳作用進行的核算和研究，蛤蜊對生態系統中碳的固定作用是相當明顯的。另一方面，貝類將水體中的懸浮物質通過消化道，經重新“包裝”后將這些顆粒物以糞便的形式運回水體，從而將水層環境和底棲環境聯系起來［8］，糞粒有機質可能是無脊椎動物消費者獲得能量的重要來源之一，因此會影響底棲動物的生長與分布。并且在一些大規模的貝類養殖海區，當水交換受到限制時，貝類所排出的糞便聚積于海底，進而導致氧的消耗和大型底棲生物數量的減少［29］。

綜上，貝類的遺傳多樣性不僅反映其自身的資源狀況，還會間接影響水域生態系統的結構和功能狀況，具有重要的研究意義。本研究通過對江蘇省啟東地區4種貝類的16S rRNA及COI基因片段序列進行分析，初步掌握其遺傳多樣性狀況，研究結果可為當地的貝類種質資源監測、保護以及海域生態修復提供數據支持。