響應面法優化赤霞珠葡萄皮渣白藜蘆醇提取工藝的研究

王海波 李薇

(武漢生物工程學院生命科學與技術學院，湖北 武漢 430415)

葡萄皮渣是葡萄發酵釀酒之后的剩余物，含有大量的多酚類物質[1,2]，其中白藜蘆醇就是重要的組成部分。研究證明，白藜蘆醇具有廣泛的生物學活性，對多種疾病有顯著的治療效果[3,4]。當前，葡萄皮渣被當作廢棄物處理，或者簡單的制作成飼料，易造成環境污染，生物利用度小，不符合對資源充分利用的發展理念[5,6]。本實驗以寧夏赤霞珠葡萄的皮渣為研究對象，采用超聲波破碎和乙醇浸提相結合、單因素實驗和響應面實驗結合分析[7,8]的方法對白藜蘆醇進行提取[9,10]，以期改進葡萄皮渣中白藜蘆醇的提取工藝條件，從而為葡萄釀酒工業中皮渣的綜合開發利用及白藜蘆醇的工業化生產提供參考。

1 實驗方法

將皮渣烘箱50℃烘干，用中草藥粉碎機粉碎40目篩過篩，用石油醚進行脫脂處理，脫脂后50℃烘干[11]。

1.1 白藜蘆醇標準曲線的制作

精確稱取0.0025g白藜蘆醇標準品，用無水乙醇完全溶解并用棕色容量瓶定容至50mL。不同稀釋倍數后，分別得到1μg·mL-1、2μg·mL-1、3μg·mL-1、4μg·mL-1、5μg·mL-1白藜蘆醇標準溶液。在波長306nm下用無水乙醇作為空白對照分別測吸光值，得出線性回歸曲線方程為y=0.194x+0.0057，其中R2=0.9997，表明白藜蘆醇濃度在1～5μg·mL-1存在較好的線性關系，可用于后期樣品的濃度分析。

1.2 白藜蘆醇提取與得率計算

稱取葡萄皮渣0.5g，加入乙醇混合均勻，水浴鍋中浸提后，3000r·min-1離心5min，取上清液稀釋100倍，在306nm下測量吸光度值，通過白藜蘆醇標準曲線計算濃度，進而計算得率。

白藜蘆醇的得率(μg·mg-1)=(C×V×n)/(m×1000)

式中，C為查標準曲線樣品液的吸光值應得白藜蘆醇含量，μg·mL-1；V為樣品液的體積，L；n為稀釋倍數；m為稱取樣品粉末的質量，g。

1.3 單因素實驗

1.3.1 乙醇濃度對白藜蘆醇得率的影響

稱取9份0.5g葡萄皮渣粉末，以料液比1∶10，分別加入55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%的乙醇溶液混合，50℃浸提60min，3000r·min-1離心5min，取上清液稀釋100倍，測定吸光度值，計算白藜蘆醇得率。實驗重復3次，取平均值。

1.3.2 料液比對白藜蘆醇得率的影響

稱取10份0.5g葡萄皮渣粉末，分別以1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35、1∶40、1∶45、1∶50、1∶55為料液比，乙醇濃度65%，50℃浸提60min，3000r·min-1離心5min，取上清液稀釋100倍，測定吸光度值，計算白藜蘆醇得率。實驗重復3次，取平均值。

1.3.3 超聲波功率對白藜蘆醇得率的影響

稱取6份0.5g葡萄皮渣粉末，料液比1∶40，乙醇濃度65%，超聲波功率為50W、100W、200W、300W、400W、500W，超聲時間10min，50℃浸提60min，3000r·min-1離心5min，取上清液稀釋100倍，測定吸光度值，計算白藜蘆醇得率。實驗重復3次，取平均值。

1.3.4 超聲波時間對白藜蘆醇得率的影響

稱取6份0.5g葡萄皮渣粉末，料液比1∶40，乙醇濃度65%，超聲波功率300W，超聲時間分別為5min、10min、15min、20min、25min、30min，50℃浸提60min，3000r·min-1離心5min，取上清液稀釋100倍，測定吸光度值，計算白藜蘆醇得率。實驗重復3次，取平均值。

1.3.5 浸提溫度對白藜蘆醇得率的影響

稱取5份0.5g葡萄皮渣粉末，料液比1∶40，乙醇濃度65%，超聲波功率300W，超聲時間25min，浸提溫度分別為35℃、40℃、45℃、50℃、55℃，浸提時間60min，3000r·min-1離心5min，取上清液稀釋100倍，測定吸光度值，計算白藜蘆醇得率。實驗重復3次，取平均值。

1.3.6 浸提時間對白藜蘆醇得率的影響

稱取5份0.5g葡萄皮渣粉末，料液比1∶40，乙醇濃度65%，超聲波功率300W，超聲時間25min，溫度45℃，浸提時間分別為15min、30min、45min、60min、75min，3000r·min-1離心5min，取上清液稀釋100倍，測定吸光度值，計算白藜蘆醇得率。實驗重復3次，取平均值。

1.4 響應面實驗

根據單因素實驗的結果，并在考慮到軟件設計條件的基礎上，選定3個因素作為考察對象，以白藜蘆醇得率為考察指標，利用Design Expert軟件來設計3因素3水平實驗，并對響應面試驗數據進行線性回歸和方差分析，確定模型和因素的顯著性。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗

2.1.1 乙醇濃度對白藜蘆醇得率的影響

從圖1可以看出，隨著乙醇濃度的增加白藜蘆醇得率逐漸升高。當乙醇濃度達到65%時，白藜蘆醇得率最高，為3.16μg·mg-1。但是當乙醇濃度超過65%時，白藜蘆醇得率逐漸下降，65%乙醇濃度有利于葡萄皮渣中白藜蘆醇的提取。

圖1 乙醇濃度對白藜蘆醇得率的影響

2.1.2 料液比對白藜蘆醇得率的影響

從圖2可以看出，當料液比逐漸增大時，白藜蘆醇得率逐漸上升。當料液比為1∶40時，白藜蘆醇得率最高，為12.63μg·mg-1。當料液比繼續增大時，雖然白藜蘆醇得率繼續上升，但是上升趨勢趨于平緩，表明料液比為1∶40時有利于葡萄皮渣中白藜蘆醇的提取。

圖2 料液比對白藜蘆醇得率的影響

2.1.3 超聲波功率對白藜蘆醇得率的影響

由圖3可以看出，當超聲波功率逐漸增大時，白藜蘆醇得率逐漸增加。當超聲波功率達到300W時，白藜蘆醇得率最高，為13.77μg·mg-1。但是，隨著超聲波功率繼續增大白藜蘆醇得率開始下降，表明超聲波功率為300W時有利于葡萄皮渣中白藜蘆醇的提取。

圖3 超聲波功率對白藜蘆醇得率的影響

2.1.4 超聲波時間對白藜蘆醇得率的影響

由圖4可以看出，隨著超聲波時間的增加，白藜蘆醇的得率逐漸上升。當超聲波時間為25min時，白藜蘆醇得率最高，為14.3μg·mg-1。但是，當超聲波時間繼續增加白藜蘆醇得率開始下降，表明超聲波時間為25min時有利于葡萄皮渣中白藜蘆醇的提取。

圖4 超聲波時間對白藜蘆醇得率的影響

2.1.5 浸提溫度對白藜蘆醇得率的影響

由圖5可以看出，隨著浸提溫度的增加，白藜蘆醇的得率隨之上升。當浸提溫度達到45℃時，白藜蘆醇的的得率最高，為15.8μg·mg-1。但是，當浸提溫度繼續提高，白藜蘆醇的得率開始下降，表明浸提溫度為45℃時有利于葡萄皮渣中白藜蘆醇的提取。

圖5 浸提溫度對白藜蘆醇得率的影響

2.1.6 浸提時間對白藜蘆醇得率的影響

由圖6可知，隨著浸提時間的增加，白藜蘆醇的得率也隨之升高。當浸提時間達到45min時，白藜蘆醇得率最高，為16.04μg·mg-1。但是，當浸提時間繼續增加，白藜蘆醇的得率開始下降，表明浸提時間為45min時有利于葡萄皮渣中白藜蘆醇的提取。

圖6 浸提時間對白藜蘆醇得率的影響

2.2 響應面實驗

根據單因素實驗結果和軟件設計要求，確定料液比1∶40、浸提溫度45℃、浸提時間45min，選取乙醇濃度(%)、超聲波時間(min)、超聲波功率(W)作為考察因素，以白藜蘆醇得率為考察指標，設計3因素3水平響應面實驗，以獲得白藜蘆醇的最佳提取條件。實驗設計見表1，實驗結果見表2。

表1 因素水平表

表2 響應面實驗設計與結果

通過Design Expert軟件進行多元回歸擬合分析得到3個因素與白藜蘆醇得率之間的二次多項式模型，式中Y為白藜蘆醇得率預測值，A為乙醇濃度，B為超聲波功率，C為超聲波時間，得出Y=17.22-0.069A+0.19B+0.28C+0.18AB-0.16AC-0.13BC-0.67A2-0.33B2-0.87C2。響應曲面二次多項式模型的方差分析見表3。

由表3可知，回歸模型(P<0.0001)極顯著，相關系數R2=0.9836，失擬項(P=0.4869>0.05)，表明失擬項相對于絕對誤差不顯著，因此實驗結果具有統計學意義，本模型擬合度良好，能較好地反映各因素與響應值之間的真實關系。且失擬項中的F值小，說明實驗值與理論值的誤差小，更能反映模型的可靠性。超聲波功率和超聲波時間對白藜蘆醇得率影響效果顯著，而乙醇濃度對提取效果的影響不顯著。根據F值大小可以判斷，這3個因素在所選的實驗范圍內影響的順序為超聲波時間(min)>超聲波功率(W)>乙醇濃度(%)。

表3 響應曲面二次多項式模型的方差分析

各因素的交互作用對白藜蘆醇得率影響如圖7～9所示。

由圖7～9可知，當乙醇濃度(A)較大、超聲波功率(B)和超聲波時間(C)較小時，響應面曲線較陡峭，同時等高線密度大，說明此時A、B、C 3因素對白藜蘆醇得率影響較為顯著。但是當A取值較小，B、C取值較大時，響應面曲線較平緩，同時等高線密度較小，說明此時各因素對白藜蘆醇得率影響較小。

圖7 得率=f(A,B)的響應面(a)和等高線(b)

圖8 得率=f(A,C)響應面(a)和等高線(b)

圖9 得率=f(B,C)響應面(a)和等高線(b)

且看3個等高線的圖形均呈現橢圓形，說明乙醇濃度、超聲波功率和超聲波時間之間的交互作用均顯著。

通過Design Expert軟件分析得到的白藜蘆醇最佳提取工藝為乙醇濃度64.82%，料液比1∶40，超聲波功率324.54W，超聲波時間25.74min，浸提溫度45℃，浸提時間45min，在此條件下，白藜蘆醇得率的理論值可達到17.2679μg·mL-1。

2.3 模型的驗證性試驗

為了驗證其可靠性，考慮到實際情況與實驗室的設備因素，采取乙醇濃度65%、料液比1∶40、超聲波功率325W、超聲波時間26min、浸提溫度45℃、浸提時間45min。根據上述條件進行3組重復驗證實驗，最后得出平均得率為17.24μg·mg-1?？芍邹继J醇得率的實驗值與理論值誤差極小，具有良好的擬合性，響應面獲得的最佳提取條件可靠。

3 結果與討論

采用乙醇浸提和超聲波破碎結合的方法，從寧夏赤霞珠釀酒葡萄皮渣中提取白藜蘆醇，研究提取時各工藝條件的影響，并輔以響應面的方法進行分析論證，最終得出最佳提取工藝條件為乙醇濃度65%，料液比1∶40，超聲波功率325W，超聲波處理時間26min，浸提溫度45℃，浸提時間45min，最終使得白藜蘆醇的得率由最初的3.16μg·mg-1提高到17.24μg·mg-1，本改進方法對于提高寧夏赤霞珠釀酒皮渣得率較為明顯。

實驗過程中，隨著乙醇濃度的增加白藜蘆醇得率有所提高，分析原因為白藜蘆醇呈弱極性，難溶于水，易溶于乙醇等有機溶劑，但是當乙醇濃度持續增大時，高濃度的醇會使白藜蘆醇轉化為白藜蘆醇甘，導致白藜蘆醇的得率下降。隨著料液比的增高，白藜蘆醇得率會提高，但當溶劑飽和時，此時再增加料液比，可能增加其他物質的溶出[8]。此外，超聲波可以更有效地破碎細胞，促進有效成分與溶劑的接觸，能夠快速有效的提取。但是超聲波在運行時會產生熱量，由于乙醇易揮發且白藜蘆醇受熱不穩定，則導致在超聲波功率過高時，反而獲得白藜蘆醇量較低[11]。同樣，因為白藜蘆醇的對熱不穩定性，當浸提溫度繼續升高時，過高的溫度容易使其分解或者轉化，反而使得白藜蘆醇的得率降低[11]。實驗中發現,隨著浸提時間的增加白藜蘆醇得率也會隨之下降，分析原因為白藜蘆醇對光不穩定，易被光氧化所致。