矮緊型、抗病同源四倍體不結球白菜矮樁秋冠新材料創制

王新雅 陳文麗 李竹帛 楊 陽 侯喜林 柳李旺 劉同坤,*

(1 南京農業大學作物遺傳與種質創新國家重點實驗室/農業部華東地區園藝作物生物學與種質創制重點實驗室/南京農業大學園藝學院，江蘇 南京 210095；2 南京理想農業科技有限公司，江蘇 南京 210095)

不結球白菜(Brassicacampastrisssp.chinensisMakino)屬十字花科蕓薹屬白菜亞種中的變種，原產于我國，品種繁多，主要在長江中下游地區種植，因其生長周期短、品質好，富含可溶性糖、可溶性蛋白、有機酸、氨基酸及人體所需的微量元素，受到人們的廣泛喜愛，在長江中下游的年均消費量約占全年蔬菜總產量的1/3[1]。近年來，北方地區也大量引進種植不結球白菜，目前不結球白菜在我國蔬菜的周年供應中占有重要地位，不結球白菜的多倍體育種為不結球白菜種質創新和新品種培育奠定了基礎。

蔬菜多倍體育種已有80余年的歷史[2]。多倍體植物的成功誘變，為我國蔬菜作物的生產與發展提供了一條全新的途徑。多倍體育種也是提高植物營養品質、增強抗逆性的有效方法之一[2]。多倍體植物抗逆性強、綜合性狀優良，使得多倍體育種變得越來越重要[3]。在生產和試驗中，多倍體的誘導方法主要包括物理方法、化學方法和生物方法。但由于誘變效果普遍偏低，物理方法誘導已經完全被化學方法誘導所取代[4]。化學方法誘導主要包括秋水仙素和其他植物激素處理。秋水仙素因其誘變效果較好、操作簡單、處理方法多樣、成本低，在植物育種中廣泛用于誘導多倍體，是最常用的化學誘變試劑[5]。近年來，秋水仙素已成功誘導出歐洲溫室黃瓜[6]、矮牽牛[7]、油菜[8]、甜葉菊[9]、青花菜[10]和不結球白菜六合矮腳黃[11]等多種植物的多倍體植株。前人研究用濃度為0.2%的秋水仙素分別處理豇豆子葉生長點[12]、二倍體蘿卜滿堂紅子葉生長點、二倍體不結球白菜超華一號莖尖生長點[13]和二倍體蘿卜小頂紅子葉生長點[14]，已成功誘導出多倍體植株，誘變率分別為2.809%、4.79%、6.44%和4.76%。

多倍體鑒定的常用方法包括形態學鑒定、解剖學鑒定、細胞學鑒定、流式細胞儀鑒定等。形態學和解剖學鑒定能夠初步篩選出疑似四倍體植株；染色體計數和流式細胞術是測定植物倍性水平的常規方法[15]。流式細胞術(flow cytometry，FCM)是近年來新興的檢測技術，通過使用流式細胞儀檢測細胞核DNA含量，經計算機統計分析，繪制分布曲線圖[16]。流式細胞術效率高、速度快、準確度高、重復性好，目前已通過該方法在百合[17]、草莓[18]、中華獼猴桃[19]等植物上成功鑒定出同源四倍體植株，但是不同植物品種利用流式細胞儀鑒定植株倍性時，在處理方法上會有所不同[20]。

矮樁秋冠是十字花科不結球白菜中的一個優良品種，葉片肥厚，植株矮壯，開展度較大，具有豐富的營養價值。四倍體植株相較于二倍體普遍具有巨大性，品質更高，抗病能力更強。作為以葉、莖為食用部位的蔬菜，不結球白菜四倍體植株能夠提高其產量和商業價值。鑒于此，本研究利用秋水仙素處理矮樁秋冠二倍體植株，通過形態學、解剖學、細胞學特征和使用流式細胞儀進行鑒定，并對篩選出的四倍體植株進行農藝性狀統計及營養品質鑒定，以期獲得優質同源四倍體植株，進一步提高矮樁秋冠的營養價值和經濟價值。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本試驗采用的材料為不結球白菜二倍體品種矮樁秋冠(2n=2X=20)多代自交系，由南京農業大學園藝學院白菜系統生物學實驗室提供。試驗于2019年9月—2020年11月在江蘇省鎮江市句容農博園試驗基地進行。

1.2 同源四倍體不結球白菜誘導方法

本試驗使用濃度為0.2%秋水仙素溶液，采用點滴的方式對二倍體植株子葉期生長點進行處理。于子葉出土后每日上午9點與下午5點分別進行1次處理，共進行5次處理，每次處理秋水仙素溶液劑量為20 μL，以蒸餾水作為對照。

1.3 多倍體的鑒定方法

1.3.1 形態學鑒定 在植株成熟后，以二倍體植株為對照，在同一時間觀察誘變植株葉片、花器官、種子、植株高度等形態學性狀[21]，對誘變植株進行初步的篩選。

1.3.2 解剖學鑒定 以氣孔和花粉粒的大小、形狀為依據，氣孔鑒定：選取疑似四倍體植株的完全展開葉，避開葉脈，撕取葉片下表皮，在光學顯微鏡(DM6B,Leica)下進行觀察，并對氣孔進行拍照。花粉粒鑒定：以二倍體花粉粒為參照，在顯微鏡下進行大小和形狀的比較，多倍體花粉粒多呈現不規則形狀[22]，觀察疑似植株花粉粒是否在大小和形態上與對照植株存在差異。

1.3.3 細胞學鑒定 將收取的疑似同源四倍體植株的種子進行催芽。將種子放置在鋪有2層濾紙的培養皿中，25℃恒溫條件下進行催芽。待種子根尖生長至1～2 cm時，將根尖切下放置在1.5 mL離心管中，冰水混合物預處理24 h后，卡諾試劑(無水乙醇∶冰醋酸為3∶1)固定24 h，隨后取出根尖放入蒸餾水中洗凈固定液。使用1 mol·L-1鹽酸在60℃條件下解離3～5 min，切取1～2 mm根尖制片，卡寶品紅染液染色10 min后，在顯微鏡下觀察并對染色體進行拍照[23]。

1.3.4 流式細胞儀倍性分析 采用流式細胞儀對細胞核內的DNA相對含量進行測定。從矮樁秋冠疑似植株上取0.1 g新鮮幼嫩葉片放置于預冷的玻璃培養皿中，加入1 mL解離液(200 mmol·L-1Tris，4 mmol·L-1MgCl2·6H2O，0.5% (v/v) TritonX-100，pH值7.5)，用預冷的刀片快速切碎，300目網過濾至1.5 mL離心管中，冰上孵育15 min，離心(4℃，4 000 r·min-1) 5 min，棄上清。重復3～5次，直至沉淀由綠色變為白色。加入染色液(0.5 mL Tris-MgCl2，10 μL RNase，7 μL碘化丙啶)混合均勻，4℃避光放置15 min后上機檢測[24]。

1.4 二、四倍體矮樁秋冠的農藝性狀統計及營養品質測定

1.4.1 農藝性狀統計 將鑒定為同源四倍體的植株M0代蕾期單株套袋，自交授粉，單株收種。將M1代種子與對照組種子同時播種。各隨機選取10株二、四倍體矮樁秋冠植株進行株高、單株質量、單葉質量、十葉厚、全株葉數、葉長、葉寬、葉柄長、葉柄寬、葉柄厚等農藝性狀的統計。

1.4.2 營養品質測定 各隨機選取3株二、四倍體矮樁秋冠植株同一部位的葉片，測定可溶性糖、可溶性蛋白、葉綠素、游離氨基酸、硝態氮以及纖維素含量等營養指標。可溶性糖含量測定采用蒽酮比色法使用MB-C-B602植物可溶性糖含量測試盒(邁博生物，廣州)；可溶性蛋白含量測定參考青格爾等[25]采用考馬斯亮藍G-250染色法；葉綠素含量測定參考甘勇輝等[26]采用乙醇提取比色法；有機酸測定參考肖平等[27]采用NaOH滴定法；硝態氮含量測定參考郭蕓琿等[28]采用硝基水楊酸比色法；纖維素含量測定使用CLL-2-Y纖維素含量測試盒(科銘生物，蘇州)測定。

1.5 光合特性分析

于晴天上午9:00—11:00，采用Li-6400便攜式光合儀(北京力高泰科技有限公司)對光響應曲線進行測定，設定CO2濃度為400 μmol·mol-1，測定其在0、20、50、100、150、250、500、750、1 000、1 200、1 500、2 000 μmol·m-2·s-1光強下單位面積凈光合速率(net photosynthetic rate, Pn)、蒸騰速率(transpiration rate Tr)、氣孔導度(stomatal conductivity, Gs)、胞間CO2濃度(intercellular CO2concentration, Ci)，每個光強下停留2～3 min，分別測定3個葉片，作3次重復。根據回歸方程分別求出光飽和點(light saturation point, LSP)、光補償點(light compensation point, LCP)、最大凈光合速率(maximum net photosynthetic rate,Pmax)、表觀量子效率(apparent quantum efficiency, AQY)、暗呼吸速率(dark breathing rate, Rday)等光合指標[29]。

注：A：植株；B：葉片；C：花器官；D：種子；E、F：氣孔；G：莢果；H、I：花粉。Note: A: Plant. B: Leaf. C: Floral organ. D: Seed. E、F: Stomata. G: Silique. H、I: Pollen.圖1 二、四倍體不結球白菜差異對比Fig.1 Comparison of tetraploid and diploid plants of non-heading Chinese cabbage

1.6 二、四倍體矮樁秋冠的抗病性測定

將菌種接種在V8固體培養基(36% V8果汁，2% 瓊脂，0.2% CaCO3)上進行繼代培養，20～25℃恒溫避光條件下培養7～14 d。待培養皿內長滿孢子后，用組培刀將菌絲刮下置于重懸液(1%蛋白胨，4%麥芽糖)中，劇烈震蕩以釋放孢子，再用紗布過濾出孢子，采用血球計數板調節孢子濃度至1×107個·mL-1。離體接種葉片時，將孢子懸浮液均勻點斑在葉片上，每個葉片2個斑，體積為10 μL，接種后的葉片放置于含有濾紙的培養皿中，12 h/12 h光暗交替、光強為400 μmol·m-2·s-1、 25℃恒溫培養箱中培養3 d，觀察葉片發病情況。于接種3 d后，以二倍體矮樁秋冠為對照組，四倍體矮樁秋冠為試驗組，取對照組和試驗組葉片病斑周圍1 cm內健康的組織，于-80℃條件下保存待測。采用實時熒光定量PCR 檢測受灰霉菌侵染的二倍體、四倍體矮樁秋冠中Botrytiscinereaactin的表達情況。每個處理設置3次重復。

1.7 數據分析

數據利用Excel 2019對所得數據進行整理，采用SPSS 20軟件對數據進行分析。

2 結果與分析

2.1 形態學與解剖學鑒定分析

如圖1所示，以二倍體為對照，同源四倍體植株開展度變小(圖1-A)；葉片變小、皺縮，葉色變淺，葉柄變短(圖1-B)；花瓣、雄蕊、柱頭、花萼相較于二倍體有所變大(圖1-C)；種子直徑增大(圖1-D)；顯微鏡觀察發現，同源四倍體氣孔孔徑變大、保衛細胞體積變大且單位面積密度變小(圖1-E、F)；種莢更為膨脹粗大(圖1-G)；二倍體花粉粒呈規則的棒狀，而同源四倍體的花粉粒呈現棒狀、矩形、菱形等多種不規則形狀(圖1-H、I)。

2.2 細胞學鑒定分析

取部分通過形態學和解剖學鑒定的疑似四倍體植株的種子進行催芽，在顯微鏡下觀察根尖細胞染色體數目，如圖2所示。二倍體染色體為2n=2X=20條，同源四倍體植株根尖染色體為2n=4X=40條證明本試驗成功誘變出同源四倍體矮樁秋冠植株，并成功收獲同源四倍體植株的種子。

2.3 流式細胞儀鑒定分析

由圖3可知，二倍體細胞核內的DNA相對含量峰值在50處，同源四倍體相對含量峰值在100處，為二倍體的2倍，通過流式細胞儀鑒定結果可再次確定細胞核內的DNA相對含量峰值在100處的植株為四倍體植株。

圖2 二、四倍體不結球白菜細胞學鑒定結果Fig.2 The cytological identification of diploid and tetraploid non-heading cabbage

圖3 二(左)、四(右)倍體不結球白菜流式細胞儀鑒定結果Fig.3 Identification results of diploid(left)and tetraploid (right) non-heading Chinese cabbage by flow cytometry

2.4 二、四倍體矮樁秋冠農藝性狀測定

由表1可知，四倍體植株的單葉質量、十葉厚分別比二倍體植株提高了13.71%、40.36%，有極顯著差異；四倍體植株的葉片數、葉寬、單株質量、葉柄厚、葉柄寬、株高、葉長、葉柄長分別比二倍體降低了1.32%、8.15%、11.03%、12.35%、15.56%、25.47%、37.82%、39.97%，其中株高、葉長、葉柄長有極顯著差異。

2.5 二、四倍體矮樁秋冠營養品質鑒定

由表2可知，四倍體矮樁秋冠可溶性糖、纖維素、葉綠素四倍體植株分別比二倍體植株降低了26.98%、43.48%、45.95%，其中纖維素含量和葉綠素總濃度有極顯著差異；硝態氮、可溶性蛋白、氨基酸含量分別比二倍體植株提高了0.47%、9.90%、14.16%，其中氨基酸有顯著差異。

表1 二、四倍體植株主要農藝學性狀比較Table 1 Comparison of main agronomic traits of diploid and tetraploid plants

表2 二、四倍體矮樁秋冠營養品質的比較Table 2 Comparison of content of nutritional substance between diploid and tetraploid non-heading cabbage

2.6 二、四倍體矮樁秋冠的光合特性分析

如圖4所示，四倍體矮樁秋冠的光合速率對光強升高的響應明顯高于二倍體，且在高光強下表現出更高的凈光合速率，說明四倍體的光合作用效率大于二倍體(圖4-A)。相同光強下，四倍體植株葉片氣孔導度明顯大于二倍體，說明四倍體矮樁秋冠比二倍體具有更強的氣體交換能力(圖4-B)。四倍體植株蒸騰速率明顯高于二倍體，再次說明在強光下四倍體的氣體交換能力更強(圖4-C)。同一光強下，四倍體胞間CO2濃度高于二倍體，與四倍體光合作用強于二倍體的結果一致(圖4-D)。由表3可知，四倍體的LSP、AQY、Rday、Pmax分別比二倍體增加10.72%、16.07%、14.09%、29.19%，LCP比二倍體降低1.11%，其中AQY有顯著差異，LSP、Rday、Pmax、LCP具有極顯著差異。說明四倍體矮樁秋冠植株對光強升高的響應以及光合作用能力均強于二倍體植株。

圖4 二、四倍體植株光合特性比較分析Fig.4 Comparative analysis of photosynthetic characteristics of diploid and tetraploid non-heading Chinese cabbage

表3 二、四倍體的光響應曲線參數的比較Table 3 Comparison of the parameters of response curves of diploid and tetraploid plants

2.7 二、四倍體矮樁秋冠抗病測定

采用實時熒光定量PCR檢測受灰霉菌侵染的二倍體、四倍體矮樁秋冠中B.cinereaactin的表達情況并觀察二、四倍體不結球白菜葉片受到灰霉菌侵染時的表型性狀。表型結果如圖5所示，對比二、四倍體不結球白菜葉片受到灰霉菌侵染時的表型圖，四倍體葉片癥狀明顯輕于二倍體。B.cinereaactin在二倍體、四倍體中均有表達，但四倍體葉片的表達量低于二倍體(圖6)。

圖5 二、四倍體不結球白菜葉片受到灰霉菌侵染時的表型圖Fig.5 Phenotype of diploid and tetraploid non-heading Chinese cabbage leaves infected by Botrytis cinerea

圖6 二、四倍體不結球白菜受到灰霉菌侵染時B.cinerea actin在葉片中的定量表達Fig.6 Quantitative expression of B.cinerea actin in the leaves of diploid and tetraploid non-heading Chinese cabbage infected by Botrytis cinerea

3 討論

多倍體植株在園藝生產中普遍比二倍體植株具有更高的營養品質、產量和抗逆性,目前誘導植物多倍化已經在多種植物中得到廣泛應用。前人研究發現,多倍體植株在外觀形態上多出現巨大化現象，但不是所有的四倍體都會產生此現象。劉惠吉等[30]選育出的南農矮腳黃四倍體植株表現出多倍體的巨大性，兩年的增產率達到22.6%和22.4%;但是袁建民等[31]誘導的四倍體小果型西瓜株型矮小緊湊,葉片肥厚,葉色深綠;何立珍等[32]誘導的同源四倍體黃花菜植株生長勢強植株矮小，莖部增粗;張曉曼等[33]誘導的同源四倍體田埂報春植株變矮,葉片變大變厚。本研究中,農藝性狀調查結果顯示,四倍體植株的株高沒有出現巨大化現象,葉面積變小、葉片肥厚,整體株型矮小緊湊，單位面積產量有所提高,四倍體植株葉色變淺，與前人研究結果基本一致。營養品質測定結果顯示,相較于二倍體，四倍體植株的氨基酸、有機酸、可溶性蛋白含量增加,葉綠素、可溶性糖、纖維素含量降低，說明四倍體部分營養品質提高,且食用口感較好,說明四倍體植株在食用價值方面有所提高。

光合作用是植物進行物質積累與生理代謝的基礎，其效率的高低與產量潛力發揮以及品質優劣密切相關。因此研究作物的光合作用對農業育種工作具有重要意義[34]。植物光合能力影響植物對光的適應能力，通過光強-光合響應曲線分析比較二、四倍體的葉片光合生理特性，曲線擬合計算出的相關參數，進一步反映植物在不同光照條件下的適應能力[35]。本試驗通過分析比較二、四倍體的光合特性發現,四倍體矮樁秋冠植株對光強升高的響應強于二倍體植株，四倍體擁有更強的光合作用能力，有利于干物質的積累。四倍體植株的LSP、AQY、Rday、Pmax均高于二倍體，LCP低于二倍體。研究中使用植物LSP和LCP作為植物對光環境適應能力的判斷依據，其中LSP較高、LCP較低的植物對光環境具有更強的適應能力[36]，結合本研究結果說明誘導后的不結球白菜四倍體的光合性能優于二倍體。染色體加倍可能導致多倍體植物的抗逆性增強[37]。本試驗通過分析二、四倍體對灰霉菌侵染的抵抗能力發現，相比于二倍體，四倍體植株具有更強的抗逆性，說明四倍體具有更好的環境適應能力。秋水仙誘導產生的同源四倍體矮樁秋冠在農藝性狀、營養品質、光合能力和抗病能力上相較于二倍體有一定程度的提高，符合育種目標的要求。同時，本研究創制的四倍體矮樁秋冠新種質是純系，能作為育種親本或直接作為常規種在生產上應用。

植株染色體加倍后，由于染色體發生變化導致染色體配對異常，與二倍體相比，四倍體植株的可育性降低，通過多代馴化可改善該情況。同時由于嵌合體[38]、基因突變和重組[39]導致誘變植株產生多種變化，在對植株進行鑒定篩選時，需選取各方面表現優良的育種材料，以提高優良品種的育種效率，從而進行下一步的研究[40]。

4 結論

本研究以二倍體不結球白菜矮樁秋冠植株為材料，獲得了矮緊型、抗病不結球白菜同源四倍體矮樁秋冠新材料，為不結球白菜種質創新和新品種培育奠定了基礎。研究發現，不結球白菜同源四倍體矮樁秋冠相較于二倍體并沒有出現巨大化現象，具體原因有待后續研究證實。不結球白菜同源四倍體矮樁秋冠新材料的創制，為研究四倍體植株相較于二倍體未出現巨大化現象的原因提供了新的研究材料。