內質網應激參與高磷誘導的血管平滑肌細胞鈣化的作用機制

段書眾，馬思佳，于文會，王歡歡，張華，王景福

（承德醫學院附屬醫院腎臟內科，河北 承德 067000）

研究顯示，慢性腎臟病患者血管鈣化的抑制和促進因素之間穩態失衡，導致血管平滑肌細胞（vascular smooth muscle cell，VSMC）向成骨細胞轉分化［1］，血管內膜、中膜及心臟瓣膜鈣化［2］。血管鈣化是心腦血管疾病的重要危險因素，與慢性腎衰竭患者心血管并發癥和全因死亡率相關［3］。研究［4］顯示高磷血癥是慢性腎臟病患者血管鈣化的決定性因素；高磷血癥導致血管鈣化的機制包括VSMC向成骨/軟骨細胞轉分化、凋亡小體形成、細胞外囊泡釋放、細胞外基質蓄積、炎性細胞因子釋放、氧化應激反應等。內質網應激參與VSMC凋亡，導致動脈粥樣硬化、高血壓、血管瘤和血管鈣化等血管疾病［5］。目前，仍無預防血管鈣化的有效手段，因此需要探索可能的藥物治療靶點［6］。內質網應激是否參與高磷誘導的VSMC鈣化鮮有報道。本研究探討內質網應激是否參與高磷誘導的血管鈣化過程及其可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 細胞培養及分組

人胸主動脈VSMC（美國ScienCell Research Laboratories）于含10%胎牛血清、100 mg/mL鏈霉素、100 U/mL青霉素的DMEM培養基中，37 ℃、5%CO2、濕度70%～80%恒溫培養箱中培養。每2 d更換1次培養液，第5～8代細胞用于實驗。設置對照組（正常培養）、磷正常濃度（1.3 mmol/L，NP）組、磷高濃度（2.6 mmol/L，HP）組、HP+SP600125組 ［應用c-Jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）抑制劑SP600125（美國Sigma-Aldrich公司，10 μmol/L）預處理30 min后，高濃度磷（2.6 mmol/L）培養基培養10 d］、HP+siCHOP組［（C/EBP homologous protein，CHOP）siRNA使CHOP基因沉默，高濃度磷（2.6 mmol/L）培養基培養10 d］。

1.2 方法

1.2.1 茜素紅染色觀察各組VSMC鈣沉積：VSMC接種到6孔板中，生長至60%時，各組實施干預措施，PBS沖洗3次，4%多聚甲醛4 ℃固定10 min，PBS沖洗3次，放入1%茜素紅S溶液內染色30 min，然后0.2%醋酸溶液快速沖洗1次，濾紙吸干后乙醇脫水，二甲苯固定、封片，顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.2 實時定量PCR檢測各組內質網應激及鈣化相關基因表達：棄去培養瓶內上清液，PBS沖洗，TRIzol法提取總RNA。取RNA 1 μg，用反轉錄試劑盒逆轉錄獲得cDNA。以cDNA作為PCR擴增模板，按照說明書配比反應體系，以GAPDH為內參基因。引物序列：骨形態發生蛋白2（bone morphogenetic protein 2，BMP-2），正向引物 5’-GGGACCCGCTGTCTTCTAGT-3’，反向引物5’-TCAACTCAAATTCGCTGAGGAC-3’；Runt相關轉錄因子2（Runt-related transcription factor 2，Runx-2），正向引物5’-ACTGTGGTTACCGTCATGGC-3’，反向引物 5’-ACTTGGTTTTTCATAACAGCGGA-3’；CHOP，正向引物5’-GGAAACAGAGTGGTCATTCC C-3’，反向引物5’-CTGCTTGAGCCGTTCATTCTC；RNA依賴的蛋白激酶樣內質網激酶（RNA-dependent protein kinase-like endoplasmic reticulum kinase，PERK），正向引物 5’-ACGATGAGACAGAGTTGCGA C-3’，反向引物 5’-ATCCAAGGCAGCAATTCTCCC-3’；肌醇需求因子1（inositol-requiring enzyme1，IRE1），正向引物5’-CATCCCCATGCCGAAGTTCA-3’，反向引物 5’-CTGCTTCTCTCCGGTCAGGA-3’；GAPDH，正向引物 5’-AGAAGGCTGGGGCTCATTTG-3’，反 向引物 5’-AGGGGCCATCCACAGTCTTC-3’。反應條件：預變性95℃、5 min；循環反應 95 ℃、15 s，60℃、30 s，共40個循環；溶解曲線95 ℃、15 s，60 ℃、1 min，95 ℃、15 s，60 ℃、15 s。基因相對表達量采用2-ΔΔCt法進行計算。

1.2.3 Western blotting檢測內質網應激蛋白CHOP、磷酸化PERK（phosphorylated PERK，p-PERK）、IRE1、磷酸化c-Jun氨基末端激酶（phosphorylated c-Jun N-terminal kinase，p-JNK）及鈣化蛋白BMP-2、Runx-2表達：于75 cm2培養瓶中培養各組VSMC，PBS洗滌3次，經裂解液在4 ℃下裂解30 min，離心、取上清液，BCA試劑盒測定蛋白含量。SDS-PAGE電泳分離蛋白組分，轉至PVDF膜上5%脫脂奶粉封閉60 min，一抗［分別為抗CHOP（1 ∶1 000）、抗BMP-2（1 ∶1 000）、抗IRE1（1 ∶1 000）、抗p-PERK（1 ∶1 000）、抗p-JNK（1 ∶500）、抗Runx-2（1 ∶1 000）和抗-β-actin（1 ∶5 000）］孵育液內4 ℃過夜，TBST洗滌3次，與相應辣根過氧化物酶標記的二抗結合，室溫孵育1 h。化學發光法顯色發光，全自動凝膠成像系統掃描、拍照，Image J軟件分析數據。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 各組VSMC鈣沉積比較

結果顯示，對照組與NP組未見鈣化表現；HP組VSMC染成深紅色，提示存在細胞鈣化；HP+SP600125組鈣化較HP組明顯減輕，提示JNK誘導細胞凋亡參與了高磷誘導的VSMC鈣化；HP+siCHOP組VSMC鈣化較HP組減輕，提示CHOP誘導的VSMC凋亡也參與了高磷誘導的VSMC鈣化。見圖1。

圖1 各組VSMC鈣沉積比較Fig.1 Comparison of VSMC calcium deposition in each group

2.2 各組VSMC鈣化相關基因BMP-2、Runx-2和內質網應激相關基因IRE1、PERK、JNK、CHOP表達比較

結果顯示，與對照組比較，NP組VSMC相關基因BMP-2、Runx-2表達無明顯增加，提示正常濃度磷無誘導VSMC鈣化的作用；而HP組BMP-2、Runx-2表達較對照組及NP組明顯增高（P＜ 0.05），提示高濃度磷可誘導VSMC鈣化。與對照組及NP組比較，HP組內質網應激相關基因IRE1、PERK、JNK及CHOP表達均顯著增加（均P＜ 0.05）。見圖2。

圖2 各組VSMC鈣化相關基因BMP-2、Runx-2，內質網應激相關基因IRE1、PERK、JNK、CHOP表達比較Fig.2 The expression of BMP-2，Runx-2，IRE1，PERK，JNK，and CHOP in each group

2.3 高磷導致VSMC內質網應激反應增強

結果顯示，與對照組及NP組比較，HP組內質網應激蛋白IRE1、p-PERK、CHOP、p-JNK表達均顯著增高（均P＜ 0.05），提示高磷培養細胞可增強內質網應激反應，并且同時激活了pPERK-CHOP和IRE1-p-JNK 2條途徑。見圖3。

圖3 各組內質網應激相關蛋白IRE1、p-PERK、JNK、CHOP表達Fig.3 Protein expression of IRE1，p-PERK，JNK，and CHOP in each group

2.4 抑制內質網應激信號傳遞可減輕高磷血癥導致的鈣化

Western blotting結果顯示，與對照組比較，CHOPsiRNA使CHOP基因沉默后凋亡蛋白CHOP表達下調，說明轉染成功敲低了CHOP表達，見圖4。與HP組比較，CHOPsiRNA使CHOP基因沉默后，CHOP表達減少，說明抑制了內質網應激p-PERK-CHOP途徑。應用JNK抑制劑SP600125抑制內質網應激的IRE1-p-JNK途徑，與HP組比較，siCHOP+HP組與SP600125+HP組鈣化蛋白BMP-2及Runx-2表達均顯著減少（均P＜0.05），提示內質網應激參與了高磷誘導的VSMC鈣化。見圖5。

圖4 VSMC轉染siCHOP后CHOP蛋白表達Fig.4 Expression of CHOP protein in VSMC transfected with siCHOP

圖5 各組鈣化蛋白BMP-2及Runx-2表達比較Fig.5 Comparison of expression of calcifying proteins BMP-2 and Runx-2 in each group

3 討論

本研究結果顯示，高磷可誘導VSMC BMP-2及Runx-2表達增加，提示VSMC發生了成骨細胞表型轉分化。血管鈣化是VSMC向成骨細胞、軟骨細胞、成脂細胞及巨噬細胞表型轉分化驅動的主動過程［6］。隨著腎臟功能逐漸減退，腎臟排泄磷功能障礙，慢性腎臟病患者普遍存在高磷血癥。研究［7］顯示，高磷啟動和促進血管鈣化進展的機制包括：（1）促進VSMC向軟骨細胞表型轉變，增加細胞外基質鈣化；（2）誘導VSMC凋亡；（3）抑制單核細胞/巨噬細胞向破骨樣細胞分化；（4）增加成纖維細胞生長因子23（fibroblast growth factor 23，FGF23）水平；（5）減少Klotho蛋白表達。已有研究［8］顯示內質網應激機制通過多種機制誘導血管鈣化。

本研究應用高磷培養基刺激VSMC表達p-JNK等內質網應激特異性蛋白，探討內質網應激是否參與高磷誘導的VSMC鈣化。結果顯示，高磷培養細胞可增強內質網應激反應；同時發現p-JNK、CHOP等凋亡相關蛋白表達增多，提示內質網應激誘導了VSMC凋亡。已有體外實驗［9］證實VSMC凋亡先于血管鈣化，凋亡小體含有高濃度鈣，它沉積到細胞外基質，作為鈣沉積的內核而引起鈣化。內質網是細胞內負責合成蛋白和脂類的細胞器，同時又是主要的鈣儲存庫，維持細胞鈣穩態；當內質網腔內未折疊蛋白或者錯誤折疊蛋白過多時，導致內質網應激穩態破壞、發生內質網應激，從而導致多種疾病發生［10］。內質網應激主要通過誘導VSMC凋亡的方式促進血管鈣化［11］，其誘導凋亡的信號通路包括：（1）PERK活化后，磷酸化真核細胞起始因子（eukaryotic initiation factor 2，eIF2）的α亞單位，進而促進轉錄激活因子4（activating transcription factor 4，ATF4）轉位入核，激活凋亡蛋白CHOP，誘導細胞凋亡［12］。（2）IRE1發生二聚化和自身磷酸化，生成的IRE1α可以募集腫瘤壞死因子受體相關因子2（TNF receptor associated factor 2，TRAF2），依次激活凋亡信號調節激酶1（apoptosis signal-regulating kinase 1，ASK1）、JNK，JNK通過抑制B淋巴細胞瘤-2基因而誘導細胞凋亡［13］。（3）內質網應激時，caspase-12活化激活caspase家族蛋白而誘導凋亡。內質網應激除了通過誘導凋亡的方式參與血管鈣化外，還激活轉錄活化因子X盒結合蛋白1（X-box binding protein 1，XBP1）結合Runx-2啟動子，促進血管平滑肌細胞轉分化［14］。

本研究在沉默CHOP基因后再高磷刺激VSMC，結果顯示BMP-2及Runx-2表達均減少，提示內質網應激的PERK-eIF2-CHOP途徑參與高磷誘導的VSMC鈣化。應用JNK抑制劑SP600125預處理高磷細胞后發現預處理后的VSMC鈣沉積減輕，提示內質網應激的IRE1-TRAF2-JNK途徑亦參與了高磷誘導的VSMC鈣化。已有研究［15］顯示體外培養子宮頸癌細胞時，細胞外液高磷環境可激活區細胞內質網應激，細胞凋亡蛋白裂解的caspase-3表達增加，但加入SP600125抑制JNK后表達減少。研究［16］顯示在糖尿病大鼠模型中，鐵死亡通過內質網應激參與心肌缺血/再灌注損傷。可見內質網應激誘導凋亡的機制可能發生在多種細胞內，因此可能成為與凋亡相關的血管鈣化等疾病的潛在治療靶點。

綜上所述，內質網應激機制參與了高磷誘導的VSMC鈣化，其作用機制可能是激活了pPERK-CHOP和IRE1-p-JNK兩條途徑。本研究不足之處：（1）未進行SP600125和CHOPsiRNA對VSMC鈣定量和堿性磷酸酶活性影響的檢測；（2）為體外實驗，僅采用細胞培養，今后應設計動物實驗來進一步論證。