己糖激酶-3在乳頭狀腎細胞癌組織中的表達及其對預后的影響

劉力源，徐雁龍

（中國醫科大學附屬第一醫院泌尿外科，沈陽 110001）

腎細胞癌（renal cell carcinoma，RCC）是泌尿系統常見的惡性腫瘤。RCC的發病率和死亡率逐年上升，預計到2040年將有超過30萬人因該病死亡［1］。乳頭狀腎細胞癌（papillary renal cell carcinoma，pRCC）是RCC第二大亞型，僅次于腎透明細胞癌，約占RCC的15%～20%［2］。pRCC的治療一直以腎透明細胞癌為參考，然而，腎癌的每個亞型在預后和治療方面都有其特異性［3］，因此，研究pRCC患者腫瘤標志物具有重要的臨床意義。

己糖激酶（hexokinase，HK）家族催化葡萄糖轉化為葡萄糖-6-磷酸是細胞代謝的第一步，也是限速步驟，哺乳動物組織中有4種HK，分別為HK1、HK2、HK3和HK4［4］。研究［5］表明，HK1和HK2在乳腺癌、甲狀腺癌、腎癌等多種惡性腫瘤組織中顯著上調，參與調節腫瘤細胞的糖酵解途徑，最終導致腫瘤患者預后不良。HK3的失活顯著影響結直腸癌糖酵解的激活，進而激活結直腸癌細胞的凋亡、內質網應激等下游信號通路，在癌癥的進展中發揮重要作用［6］。迄今為止，尚未有關于HK3在pRCC中的表達差異與臨床預后的報道，本研究通過觀察和分析pRCC癌組織中HK3的表達情況，旨在探討其與pRCC患者的臨床特征及預后的關系。

1 材料與方法

1.1 公共數據庫

TCGA數據庫（https：//tcgadata.nci.nih.gov/tcga/）是用于從GDC數據門戶檢索和處理數據的程序。從pRCC基因表達芯片中篩選出癌組織290例，健康組織32 例。比較HK3在癌組織與健康組織、不同分期及不同淋巴結轉移的表達水平。

1.2 臨床標本

選取2017年1月1日至2021年12月31日于我院就診的pRCC患者癌組織和癌旁組織樣本蠟塊共46例，其中，男22例，女24例。納入標準：（1）經腎癌病理組專家確診為pRCC；（2）診斷標準符合2012年國際泌尿病理協會對該病的定義；（3）年齡＞18周歲。排除標準：（1）合并其他惡性腫瘤；（2）術前接受過其他方式治療；（3）嚴重心肺功能不全。本研究獲得中國醫科大學附屬第一醫院倫理委員會批準，所有患者簽署知情同意書。

1.3 主要試劑

石蠟包埋組織蛋白提取試劑盒（北京英文特生物技術有限公司），細胞裂解液（RIPA，上海碧云天生物技術有限公司）；蛋白酶抑制劑（PSMF，上海碧云天生物技術有限公司）；BCA試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司）；HK3抗體（英國Abcam公司，貨號：ab126217）；GAPDH抗體（美國CST公司，貨號：5174）；辣根酶標記山羊抗兔（北京中杉金橋生物技術有限公司）。

1.4 Western blotting

用組織切片機從石蠟中切取適量厚度的組織（約10～20 μm），按照試劑盒說明書步驟獲取組織蠟塊總蛋白，離心后加入組織裂解液（RIPA ∶PSMF=100 ∶1）。隨后使用BCA法測定蛋白質濃度。制備12% SDS-PAGE凝膠，經電泳后轉膜，5%脫脂奶粉封閉1 h。按照抗體說明書將一抗稀釋相應倍數，將膜與抗體置于4 ℃下孵育過夜。TBST洗膜3次，每次10 min，室溫下二抗孵育1 h后暗室內曝光顯影。用Image J 軟件處理蛋白圖像，GAPDH作為標準化對照。

1.5 統計學分析

采用GraphPad Prism Version 7.0進行數據分析；組間比較采用student-t檢驗；計數資料比較采用χ2檢驗；采用Kaplan-Meier法及log-rank檢驗繪制生存曲線并比較生存差異。P＜ 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 HK3在pRCC患者癌組織及癌旁組織中的表達情況

TCGA基因表達芯片數據中，HK3在癌組織中的mRNA表達水平明顯高于癌旁組織（P＜ 0.001）（圖1A）。此外，分析了HK3的mRNA表達水平與腫瘤分期、淋巴結轉移的關系，結果顯示，HK3的轉錄水平在Stage 1～3期，以及N0～1期均明顯高于正常組織的表達水平（圖1B、1C），差異有統計學意義（P＜ 0.01）。而正常組織與Stage 4期、N2期無統計學差異，這可能與數據庫中Stage 4期、N2期患者數量較少有關。

圖1 TCGA數據庫中pRCC組織及正常腎組織中HK3 mRNA的表達Fig.1 Expression of HK3 mRNA in pRCC and normal renal tissue from the TCGA database

考慮到基因的轉錄調控、翻譯后修飾等涉及到許多生物信息學過程，因此，HK3的轉錄水平并不能代表蛋白水平。隨后通過Western blotting檢測了HK3蛋白在癌組織與癌旁組織中的表達差異，結果進一步證實，HK3的蛋白水平在癌組織中表達明顯高于癌旁組織（P＜ 0.001），見圖2。

圖2 HK3在pRCC組織及正常腎組織中的蛋白表達情況Fig.2 Protein expression of HK3 in pRCC and normal renal tissue

2.2 HK3表達與pRCC患者臨床病理特征的關系

根據HK3蛋白表達的中位數將臨床癌組織樣本分為高表達組與低表達組。結果顯示，pRCC癌組織中HK3的表達水平與該腫瘤的T分期、Fuhrman核分級明顯相關（P＜ 0.01）；而與患者的性別、年齡、淋巴結轉移無關（P＞ 0.05），見表1。

表1 HK3表達與pRCC患者的臨床病理特征的關系［n（%）］Tab.1 Relationship between HK3 expression and clinical pathological features in pRCC ［n（%）］

2.3 HK3在pRCC組織中的表達與生存預后的關系

通過電話隨訪和我院復查資料匯總等方式獲得患者復發、轉移及生存的信息。截至2022年3月1日，疾病進展患者14例，死亡患者12例，存活29例，失訪5例。Kaplan-Meier曲線提示HK3高表達組的無病生存期（disease-free survival，DFS）及總體生存期（overall survival，OS）均低于低表達組（P＜ 0.05），見圖3。

圖3 不同HK3表達水平的患者的生存曲線Fig.3 Survival curves for patients with different HK3 expression levels

3 討論

糖酵解是正常組織在低氧條件下發生的自然過程。在氧氣充足的惡性腫瘤區域也可以觀察到糖酵解。這種現象稱為“有氧糖酵解”或“沃伯格效應［7］。糖酵解可以為癌細胞提供ATP，從而促進其生長和代謝。因此，糖酵解可能是惡性腫瘤的一個潛在的預后指標［8］。

HK的功能主要是催化葡萄糖代謝的第一步，使葡萄糖磷酸化成葡萄糖-6-磷酸［9］。HK在腫瘤細胞糖酵解等多種生物過程中發揮著關鍵作用。然而，對HK家族基因在不同類型癌癥中的作用仍缺乏系統的認識［10］。HK3是糖酵解的關鍵基因，主要分布于骨髓、肺和脾臟［11］。HK3和環加氧酶-2可能通過糖酵解和花生四烯酸代謝在小兒急性淋巴細胞白血病及其預后中發揮重要作用，可能成為治療該病的潛在靶點［12］。此外，HK3表達下調會導致中性粒細胞分化和活性顯著降低［13］。

研究［14］報道，HK3在腎透明細胞癌組織中呈現高表達，并且參與調節腎透明細胞癌細胞免疫微環境與免疫逃逸。另有研究［15］顯示在非小細胞肺癌中，HK3與免疫浸潤相關，并可以作為預測非小細胞肺癌免疫治療的反應程度。本研究結果顯示，通過TCGA數據庫分析與蛋白免疫印跡實驗，發現在pRCC患者中，HK3的轉錄水平與蛋白水平明顯高表達于癌旁健康組織，提示HK3可能促進pRCC的發生發展。此結果與HK3在結腸癌中高表達結果一致［16］。為進一步明確HK3的表達對pRCC的影響，本研究分析了腫瘤患者HK3的表達與其臨床特征的關系，結果表明HK3的表達水平與腫瘤的T分期、Fuhrman核分級明顯相關，差異有統計學意義（P＜0.01）；而與患者的性別、年齡、淋巴結轉移無關，差異無統計學意義（P＞ 0.05）。隨后，根據隨訪結果分析顯示，HK3高表達組的DFS及OS均低于低表達組（P＜ 0.05）。這一結果提示HK3的高表達可能與pRCC的發展有關，可以作為pRCC的輔助指標。

綜上所述，pRCC患者腫瘤組織中HK3蛋白水平高表達可能會促進患者的病程發展。HK3可能成為pRCC的鑒別診斷及預后評價指標，是潛在的腫瘤標志物。為進一步研究HK3在pRCC的生物學功能提供依據，對指導臨床治療及預后預測有一定的參考意義。