環狀RNA hsa_circ_0009043在口腔鱗狀細胞癌中的表達及臨床意義

房旭，劉維賢

（中國醫科大學附屬盛京醫院口腔頜面外科，沈陽 110004）

口腔鱗狀細胞癌（oral squamous cell carcinoma，OSCC）占口腔癌的95%以上［1］，具有很強的復發、侵襲、轉移能力［2］。盡管近年來在診斷和治療方面取得了一些進展，但OSCC患者的5年生存率仍低于50%［3］，未能早期診斷是導致高死亡率的重要原因。因此，探索OSCC的發生機制是指導OSCC診斷和治療的重點。

環狀RNA（circular RNA，circRNA）是一種內源性非編碼RNA，由前體mRNA反向剪接產生，具有可區分的單鏈，共價閉環，缺乏5’-3’極性等特點［4］。這種獨特的結構使circRNA廣泛分布于細胞質中，并對外切酶更具抵抗力，比線性RNA更穩定［5］。研究［6-7］表明，circRNA作為微RNA（microRNA，miRNA）分子的海綿具有巨大的潛力，以互補的堿基配對方式抑制miRNA活性，從而促進下游靶基因的翻譯和穩定性。這種circRNA/miRNA/mRNA信號軸已被證明可在各種生理和病理條件下發揮多種功能［8-10］。已有研究［11］通過基因篩選發現，與子宮內膜癌旁組織相比，子宮內膜癌中hsa_circ_0009043表達顯著下調，但它在OSCC中的表達情況尚不明確。

本研究擬探討hsa_circ_0009043在OSCC組織中的表達情況，并結合相關病理因素分析其在OSCC發生、發展中的臨床意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 組織標本：收集2018年6月至2020年12月于中國醫科大學附屬盛京醫院口腔頜面科接受手術治療的48例OSCC患者的腫瘤及癌旁組織。所有患者術前均未接受過放化療等治療，且均經病理學檢查確診為OSCC。所有組織離體后立即置于液氮中，冷凍保存備用。所有患者均簽署知情同意書。本研究獲得中國醫科大學附屬盛京醫院倫理委員會批準。

1.1.2 細胞：OSCC細胞系SCC-9、SCC-15、CAL-27購自上海西寶生物科技有限公司。正常人口腔角質細胞（human oral keratinocytes，HOK）購自上海酶聯科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 實時定量聚合酶鏈式反應（quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR）：用TRIzol試 劑盒獲得組織和細胞的總RNA。采用RNA反轉錄試劑盒將RNA反轉錄為cDNA。采用Light Cycler 480ⅡReal-Time PCR系統進行qRT-PCR檢測。GAPDH作為內參照。GAPDH正向引物序列為5’-CAGGAG GCATTGCTGATGAT-3’，反向引物序列為5’-GAAG GCTGGGGCTCATTT-3’；hsa_circ_0009043正向引物序列為5’-TGGTGGACAACATCCCCAAG-3’，反向引物序列為 5’-ACTTGATTTTGCTTCATGGCAGT-3’。

1.2.2 hsa_circ_0009043功能富集分析及circRNA/miRNA/mRNA網絡構建：對hsa_circ_0009043進行基因本體（Gene Ontology，GO）和京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）富集通路分析，P＜ 0.05表示富集結果顯著。利用Mireap軟件、Miranda（http：//www.microrna.org/microrna/home.do）和TargetScan（http：//www.targetscan.org）數據庫預測下游miRNA，并利用miRTarBase 數據 庫（http：//mirtarbase.mbc.nctu.edu.tw/index.html）預測miRNA靶標mRNA，進而構建circRNA/miRNA/mRNA網絡。

1.3 統計學分析

采用SPSS 23.0和GraphPad Prism 7.0軟件進行統計分析。采用t檢驗比較OSCC組織與配對的癌旁組織中hsa_circ_0009043表達水平的差異。通過非參數檢驗評估hsa_circ_0009043表達與臨床病理特征之間的關系。通過受試者操作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線評估hsa_circ_0009043的診斷價值。每個實驗重復3次。P＜ 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 hsa_circ_0009043在組織和細胞中的表達情況

qRT-PCR結果顯示，OSCC細胞系SCC-9和CAL-27中hsa_circ_0009043表達水平較正常HOK顯著降低（P＜ 0.01；P＜ 0.001），見圖1A；OSCC組織中hsa_circ_0009043表達水平［5.117（3.722～6.933）］較癌旁組織［3.849（2.945～5.088）］顯著降低（P＜ 0.001），見圖1B。

圖1 hsa_circ_0009043在OSCC組織及細胞中低表達Fig.1 Decreased expression of hsa_circ_0009043 in OSCC tissues and OSCC cells

2.2 hsa_circ_0009043表達水平與臨床病理特征的相關性

如表1所示，臨床病理特征分析結果顯示，hsa_circ_0009043的表達水平與腫瘤大小和淋巴結轉移相關（P=0.01，P=0.037），與是否吸煙、飲酒等則無相關性。

表1 hsa_circ_0009043表達水平與患者臨床病理特征的關系Tab.1 Relationship between hsa_circ_0009043 expression levels and patients’ clinical pathological characteristics

2.3 hsa_circ_0009043對OSCC的診斷價值

ROC曲線評估結果顯示，hsa_circ_0009043的ROC曲線下面積（area under curve，AUC）為0.6769（P＜ 0.01，95%CI：0.570 0～0783 7），見圖2。

圖2 hsa_circ_0009043診斷OSCC的ROC曲線Fig.2 The ROC curve of OSCC diagnosis by hsa_circ_0009043

2.4 circRNA/miRNA/mRNA相互作用網絡預測

為了探索hsa_circ_0009043的潛在功能，對目標基因進行了GO及KEGG富集分析。GO富集分析發現，在分子功能、細胞組分及生物學過程中富集最強烈的分別是磷脂酰肌醇3-磷酸酶活性、被膜小泡及血管生成，見圖3A。KEGG富集分析的前10個條目顯示hsa_circ_0009043可能與多種腫瘤存在相關性，如肝癌、非小細胞肺癌等，見圖3B。為了進一步確定hsa_circ_0009043的分子機制，構建了circRNA/miRNA/mRNA相互作用網絡。結果顯示，hsa_circ_0009043可能與hsa-miR-148b-3p、hsa-miR-148a-3p、hsa-miR-7-5p和hsa-miR-152-3p相互作用，并間接調控61個靶基因，見圖3C。

圖3 hsa_circ_0009043的潛在功能分析Fig.3 Potential functional analysis of hsa_circ_0009043

3 討論

circRNA是一種可以調節基因表達的非編碼RNA［12］，與多種腫瘤的發生發展機制密切相關［13-15］。有研究［16］發現，circRNA的差異表達與腫瘤的遠處轉移、TNM分期等臨床病理特征顯著相關。因此，circRNA的出現為探索腫瘤發病機制和尋找癌癥的潛在生物標志物提供了新的方向。與其他惡性腫瘤一樣，OSCC的發生發展也是涉及編碼和非編碼基因的復雜生物學過程［17］。識別臨床相關的OSCC特異性circRNA，并檢測其功能及對OSCC的調控作用是了解該疾病的關鍵。

本研究首次發現在OSCC組織和細胞系中，hsa_circ_0009043表達顯著下調。對臨床病理相關資料的分析發現，hsa_circ_0009043的表達水平與腫瘤大小和淋巴結轉移相關。ROC曲線結果顯示，hsa_circ_0009043的表達與OSCC診斷具有相關性。提示hsa_circ_0009043是一種對OSCC的早期診斷和治療具有一定價值的新型生物標志物。

為了探索hsa_circ_0009043與OSCC發生、發展的關系，本研究還進行了GO、KEGG富集分析，結果顯示，EGFR tyrosine kinase inhibitors與hsa_circ_0009043相關性最強，與已有研究［18］結果一致。以上結果均證實了hsa_circ_0009043在OSCC發生發展中的重要作用。

研究［19-20］表明，競爭性內源RNA（competing endogenous RNA，CeRNA）在腫瘤細胞的擴張、侵襲和轉移中發揮著重要作用。circRNA可作為CeRNA參與調控腫瘤的CeRNA網絡［21-22］。本研究中，利用Target Scan、miRTarBase等數據庫，構建了hsa_circ_0009043/miRNA/mRNA網絡以預測hsa_circ_0009043可能發揮的作用機制，發現hsa_circ_0009043可能與hsamiR-148b-3p、hsa-miR-148a-3p、hsa-miR-7-5p和hsamiR-152-3p相互作用，并間接調控61個靶基因。說明hsa_circ_0009043可通過miRNA的海綿效應促進癌癥的進展。

綜上所述，本研究首次發現hsa_circ_0009043在OSCC細胞系及組織中表達水平顯著下降，并與OSCC的臨床病理特征及診斷相關。同時，通過生物信息學分析，對hsa_circ_0009043參與OSCC的可能的分子機制進行了預測。因此，hsa_circ_0009043具有成為OSCC生物標志物的潛力，但其具體作用機制仍有待進一步研究。