circPRKAG2在結直腸癌中的表達及功能分析

李向南 沈 薦 李敏哲 王振軍

在全球范圍內，結直腸癌發生率在所有惡性腫瘤中排名第2位，病死率排名第3位[1]。結直腸癌患者5年生存率為64%，但晚期結直腸癌患者5年生存率僅為12%[2]。靶向治療為降低晚期結直腸癌患者病死率帶來了希望，然而耐藥等問題導致生存獲益并不十分理想[3]。因此，有必要進一步拓展新的結直腸癌治療靶點。近年來，環狀RNA(circular RNA，circRNA)與腫瘤的關系成為研究熱點。circRNA是一種通過反向剪接形成的特殊環狀結構RNA[4]。circRNA在腫瘤發生、發展、代謝以及免疫等多方面發揮重要作用，有望成為新的治療靶點[5～8]。筆者前期對circRNA與結直腸癌的關系進行了探索[9～12]。其中，筆者通過轉錄組測序發現了一個新的circRNA，即circPRKAG2。circPRKAG2近年來已被circBase數據庫收錄(circBase ID: hsa_circ_0142408)[9,13,14]。筆者測序結果顯示，circPRKAG2在結直腸癌組織中顯著下調，差異倍數(fold change，FC)為0.002。然而，circPRKAG2的功能尚不清楚。因此，本研究旨在分析circPRKAG2在結直腸癌組織中的表達及其對結直腸癌細胞惡性表型的影響。

材料與方法

1.標本收集：收集2016年9月～2019年7月在首都醫科大學附屬北京朝陽醫院接受手術治療的68例結直腸癌患者標本。納入標準：①均為原發性結直腸癌患者；②術前未接受放療、化療及其他新輔助治療；③臨床及病理資料完整。標本包括癌組織和癌旁非腫瘤組織。標本離體經液氮速凍后存儲于-80℃冰箱。本研究通過首都醫科大學附屬北京朝陽醫院醫學倫理學委員會審批(倫理審批號：2021-科-127)。

2.細胞培養：人結直腸癌細胞株SW480和HCT116購自美國模式培養物集存庫(American type culture collection，ATCC)。細胞培養方法：基礎培養基+10%胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)+100U/ml青霉素以及100μg/ml鏈霉素。對于SW480細胞，基礎培養基采用DMEM；對于HCT116細胞，基礎培養基采用McCoy′s 5A。基礎培養基、FBS、青霉素和鏈霉素均購自美國Gibco公司。

3.實時熒光定量PCR(qRT-PCR)：利用 Trizol(美國Invitrogen公司)試劑提取RNA。反轉錄和qRT-PCR試劑盒購自日本TaKaRa公司。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。熒光定量PCR儀購自美國ABI公司。引物序列如下：circPRKAG2上游引物：5′-CGGGGGCATCAGGTTTTTCT-3′，下游引物：5′-GGCTGTCCACCTTTCGAGA-3′；PRKAG2 mRNA上游引物：5′-CTTGGGCACAGGCATAGGAG-3′，下游引物：5′-CATTTTCCACCCTCTCGGCT-3′；內參基因18S rRNA上游引物：5′-AAACGGCTACCACATCCA-3′，下游引物：5′-CACCAGACTTGCCCCTCCA-3′。熒光定量PCR的結果使用2-ΔΔCt法分析。

4.siRNA轉染：針對circPRKAG2反向剪接位點設計兩條小干擾RNA(small interfering RNA，siRNA)。siRNA及陰性對照(si-NC)由上海吉瑪制藥有限公司合成。序列如下：si-#1：5′-CCCGCTCCAGAAAAAGACC-3′；si-#2：5′-GCTCCAGAAAAAGACCTGA-3′；si-NC：5′-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3′。轉染試劑Lipofectamine3000購自美國Invitrogen公司。

5.細胞增殖實驗：CCK-8細胞增殖檢測試劑盒購自江蘇凱基生物公司。結直腸癌細胞以每孔1.0×103個接種于96孔板，每孔設置5個復孔。分別在細胞培養0、1、2、3和4天后加入CCK-8試劑10微升/孔。孵育2h后，利用酶標儀檢測450nm處吸光度(A)值。計算5孔平均A值，以時間為橫坐標，A值為縱坐標繪制細胞生長曲線。

6.克隆形成實驗：結直腸癌細胞以每孔5.0×102個接種于6孔板，每孔設置3個復孔。在細胞培養箱中孵育2周。棄去培養基，4%多聚甲醛固定，0.1%結晶紫染色。洗去殘余染色液，對6孔板拍照并統計細胞克隆數量。

7.細胞遷移和侵襲實驗：使用Transwell小室(無錫NEST公司)進行細胞遷移和侵襲實驗。侵襲實驗中使用的Matrigel購自美國Corning公司。接種約10×104個結直腸癌細胞至上室，細胞懸液體積為200μl。下室為700μl含有20% FBS的完全培養基。48h后吸除培養基，4%多聚甲醛固定，0.1%結晶紫染色。用濕棉簽輕輕拭去小室基膜上層細胞。使用倒置顯微鏡以100倍拍攝，觀察并計算5個隨機視野的遷移或侵襲細胞數。

8.分組：根據circ PRKAG2相對表達量的中位數作為界值，將68例結直腸癌組織分為低表達組和高表達組，低表達組為34例，高表達組為34例；細胞實驗中，實驗組為si-#1和si-#2組，對照組為si-NC組。

9.統計學方法：使用SPSS 23.0統計學軟件對數據進行統計分析。使用GraphPad Prism 7.0軟件繪圖。癌及癌旁非腫瘤組織之間circPRKAG2表達水平的比較采用Wilcoxon符號秩檢驗；兩組細胞各指標的比較采用t檢驗；不同臨床病理特征間circPRKAG2表達水平的比較采用χ2檢驗,以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1.circPRKAG2在結直腸癌組織中呈現低表達：qRT-PCR結果顯示，與癌旁非腫瘤組織比較，結直腸癌組織中circPRKAG2表達水平顯著下降(P<0.001)。Sanger測序證實circPRKAG2的反向剪接位點(圖1)。

圖1 circPRKAG2在結直腸癌組織中顯著下調

2.circPRKAG2表達水平與結直腸癌不良臨床病理特征呈負相關：qRT-PCR結果顯示，81%的癌組織(55/68)表現為circPRKAG2下調。利用circPRKAG2相對表達量的中位數作為界值，筆者將68例結直腸癌患者分為高表達組和低表達組(圖2)。利用χ2檢驗分析circPRKAG2表達水平與結直腸癌患者臨床病理特征之間的關系。結果表明，circPRKAG2表達水平與患者性別、年齡、腫瘤部位、腫瘤直徑以及分化程度均無明顯相關性(P>0.05)，但與腫瘤浸潤深度、淋巴結轉移、遠處轉移以及TNM分期均呈顯著負相關(P<0.05，表1)。

圖2 circPRKAG2在68對結直腸癌組織中的具體表達情況

表1 circPRKAG2表達水平與結直腸癌臨床病理特征之間的關系[n(%)]

3.利用siRNA干擾結直腸癌細胞中circPRKAG2的表達：向結直腸癌細胞中轉染siRNA后，提取RNA，行qRT-PCR驗證。結果表明，兩條siRNA中，si-#2的敲除效率更高，其在兩個細胞系中干擾效率均>80%(P<0.001)。另外，si-#2對circPRKAG2宿主基因來源的PRKAG2 mRNA的相對表達量無影響(圖3)。因此，筆者利用si-#2轉染細胞并進行體外細胞功能實驗。

圖3 siRNA干擾結直腸癌細胞中circPRKAG2的表達

4.干擾circPRKAG2能夠促進結直腸癌細胞克隆形成能力：對si-NC組和si-#2組結直腸癌細胞進行克隆形成實驗，結果表明，si-#2組細胞克隆數量顯著多于si-NC組(P<0.001，圖4)

圖4 干擾circPRKAG2促進結直腸癌細胞克隆形成能力(結晶紫染色)

5.干擾circPRKAG2能夠促進結直腸癌細胞增殖能力：對si-NC組和si-#2組結直腸癌細胞進行細胞增殖實驗，結果表明干擾circPRKAG2后結直腸癌細胞增殖能力顯著升高(P<0.001，圖5)。

圖5 干擾circPRKAG2促進結直腸癌細胞增殖能力

6.干擾circPRKAG2能夠促進結直腸癌細胞遷移能力：對si-NC組和si-#2組結直腸癌細胞進行細胞遷移實驗，結果表明si-#2組遷移至小室基膜下層的細胞數顯著高于si-NC組(P<0.05，圖6)。

圖6 干擾circPRKAG2促進結直腸癌細胞遷移能力(結晶紫染色)

7.干擾circPRKAG2能夠促進結直腸癌細胞侵襲能力：對si-NC組和si-#2組結直腸癌細胞進行細胞侵襲實驗，結果表明si-#2組侵襲至小室基膜下層的細胞數顯著高于si-NC組(P<0.01，圖7)。

圖7 干擾circPRKAG2促進結直腸癌細胞侵襲能力(結晶紫染色)

討 論

circRNA于1979年在植物病毒中首次被發現[15]。circRNA最初被認為是剪接錯誤產生的低豐度、無意義RNA[4]。近年來，隨著高通量測序和生物信息學的發展，circRNA被發現廣泛表達于各類細胞和組織，并在多種惡性腫瘤中存在表達調控異常[16～18]。研究表明，circRNA能通過多種機制影響腫瘤細胞惡性表型。例如，circSDHC作為miR-127-3p的分子海綿，通過上調周期蛋白依賴性激酶抑制因子3/E2F轉錄因子1信號通路促進腎癌增殖和轉移[19]。circPCNX通過結合AU結合因子1，阻斷后者進一步結合p21 mRNA，促進p21 mRNA穩定化和蛋白表達，進而抑制宮頸癌細胞增殖[20]。此外，研究表明circRNA能穩定表達于血漿、血清、外泌體和尿液等多種體液，有望成為新的腫瘤診斷標志物[21]。

筆者前期利用轉錄組測序發現了一系列在結直腸癌組織中差異表達的circRNA[9]。通過進一步研究發現，其中多種circRNA在結直腸癌進展中發揮重要作用[10～12]。例如circDDX17在結直腸癌中發揮抑癌分子作用[9]；circVAPA通過吸附miR-101促進結直腸癌細胞惡性表型[10]；circHUWE1通過吸附miR-486促進結直腸癌細胞增殖、遷移和侵襲[11]；circRUNX1通過miR-145-5p/IGF1信號通路促進結直腸癌進展[12]。

筆者的測序結果顯示，在所有結直腸癌差異表達的circRNA中，circPRKAG2表達量最低，其FC值僅為0.002，P=2.52×10-6。circPRKAG2的功能尚未見報道。本研究利用qRT-PCR在68對結直腸癌和癌旁非瘤組織中驗證circPRKAG2的表達。結果表明，circPRKAG2在結直腸癌組織中顯著下調。另外，circPRKAG2的表達水平與腫瘤浸潤深度、淋巴結轉移、遠處轉移以及TNM分期等不良臨床病理特征呈負相關。體外實驗進一步表明，干擾circPRKAG2顯著促進結直腸癌細胞克隆形成、增殖、遷移和侵襲能力，提示circPRKAG2在結直腸癌中可能發揮抑癌分子作用。

circPRKAG2的宿主基因為腺苷-磷酸激活的蛋白激酶γ2調節亞單位基因(protein kinase AMP-activated non-catalytic subunit gamma 2，PRKAG2)。PRKAG2與惡性腫瘤關系密切[22～24]。研究表明，PRKAG2基因存在多種單核苷酸多態性，例如rs7789674、rs6964824等。這些基因變異與結直腸癌的發生、發展密切相關[22]。在肝癌中PRKAG2可增強化療藥物敏感度，并可作為肝癌預后預測的生物學標志物[23]。PRKAG2來源的長鏈非編碼RNA PRKAG2-AS1在結直腸癌、前列腺癌和食管癌中表達上調，且促進腫瘤細胞的惡性表型[24]。由此可見，PRKAG2除了本身作為一種重要的腫瘤相關基因，還能生成多種類型非編碼RNA來調控腫瘤進展。

綜上所述，本研究初步證實circPRKAG2在結直腸癌中發揮抑癌分子作用。circPRKAG2在結直腸癌組織中表達下調。circPRKAG2的表達水平與腫瘤浸潤深度、淋巴結轉移、遠處轉移以及TNM分期呈負相關。circPRKAG2體外抑制結直腸癌細胞惡性表型。因此，circPRKAG2可能在結直腸癌中發揮抑癌分子作用，其具體機制仍需進一步研究。