兔乳腺癌轉移淋巴結模型的建立及常見超聲技術評價

嚴麗娟 周 軍 田 順 許 濤 趙 云

乳腺癌是威脅女性健康的最常見的惡性腫瘤之一，乳腺癌病死率高的主要原因是乳腺癌轉移，最常見的轉移方式是淋巴結轉移[1]。為了進一步研究該疾病，建立合適的動物模型十分必要。本研究建立新西蘭大白兔乳腺癌轉移淋巴結模型，采用二維超聲、彩色多普勒超聲、彈性成像及超聲造影觀察瘤體及轉移淋巴結生長特征，評估該造模方法應用于相關研究的可行性。

材料與方法

1.實驗動物：普通級新西蘭大白兔20只，8月齡，其中雄性5只，雌性15只，體質量為2.5～3.0kg， 均購自湖北逸摯誠生物科技有限公司，實驗動物許可證號：SCXK(鄂)2021-0020。

2.實驗材料與儀器：VX2腫瘤組織(重慶博培生物技術有限公司)，聲諾維(意大利Bracco公司)。Mindray Resona7S超聲診斷儀(中國深圳Mindray公司)，L14-5WU線陣探頭，頻率(5～14)MHz。水浴鍋(常州澳華公司)。正置白光拍照顯微鏡(日本Nikon公司)，型號Eclipse Ci-L。

3.模型建立：取-80℃冰箱保存的腫瘤組織，快速在37℃水浴鍋解凍，離心去除凍存液，在超凈工作臺中，用外科剪將VX2腫瘤組織剪碎為1～2mm3體積大小，冰上保存備用。首先建立荷瘤兔。用固定器將雄性兔仰臥位固定，10%水合氯醛2ml/kg通過耳緣靜脈緩慢注射進行麻醉。待角膜反射減弱、肌肉松弛或呼吸減慢即可進行下述操作。采用切開植入法將腫瘤組織種植于兔的左下肢，穿刺針植入法將腫瘤組織種植于同一只兔的右下肢，比較兩種方法的種植效果。切開植入法：用無菌手術刀于5只雄兔左下肢肌肉豐富處(已備皮)切開約1cm開口，將剪碎的VX2腫瘤組織移入切口內，逐層縫合，碘伏消毒，敷貼遮蔽切口。穿刺針植入法：將瘤粒置于18G穿刺針針頭頭端處，穿刺進入上述5只雄兔右下肢肌肉豐富處(已備皮)，用內芯將瘤粒頂出，緩慢拔出穿刺針，消毒，敷貼遮蔽。約3周后在植入部位見包塊凸出，荷瘤兔即制備成功。約3周后無菌條件下將瘤組織取出，制備兔乳腺癌轉移淋巴結模型。用慶大霉素和0.9%NaCl注射液混合液清洗瘤體。在另一培養皿中用眼科剪將瘤塊裁剪成1～2mm3備用，所有操作于冰上進行。麻醉(10%水合氯醛2ml/kg)后將實驗雌兔仰臥位固定，剃毛，按外科無菌程序消毒術區皮膚，鋪巾。左側胸壁第3乳頭外上象限處切開長度約1cm切口，鈍性分離筋膜暴露乳墊，取1塊備用的腫瘤組織植入切口底部?？p合后當天切口處撒青霉素，術后3天每天肌內注射青霉素預防感染。每周觀察腫瘤的生長情況，并記錄腫瘤最大直徑，直至直接觸診到淋巴結或超聲觀察到約1cm異常淋巴結。

4.超聲檢查：采用Mindray Resona7S超聲診斷儀，L14-5WU線陣探頭，頻率(5～14)MHz。檢查前先對觀察區剃毛，10%水合氯醛2ml/kg通過耳緣靜脈緩慢注射進行麻醉，兔仰臥位固定，充分暴露待觀察區。先二維多切面掃查瘤體，觀察其大小、形態、邊界、內部回聲，再進行彩色多普勒檢查，觀察其血流動力學特征。觀察轉移淋巴結時，先觸診找到顆粒狀淋巴結大致位置，再多切面掃查，除觀察上述特征之外，還需觀察其淋巴門結構。之后點擊彈性成像模式，使取樣框盡量覆蓋腫瘤及轉移淋巴結，腫瘤較大探頭難以完全覆蓋時，多方位成像，固定而不加壓，持續至少5s，待圖像穩定能清晰時存圖，重復3次。最后給予超聲造影檢查，將5ml 0.9%氯化鈉注射液加入造影劑聲諾維中制成混液，確定病灶部位，取最大切面，固定探頭，耳緣靜脈注射混液3ml，進行實時造影檢查，觀察增強模式及強度。

5.病理學觀察：靜脈注射空氣處死實驗兔后，取腫瘤及淋巴結，4%多聚甲醛固定、脫水、石蠟包埋、組織切片、HE染色，光學顯微鏡下觀察其組織形態。

結 果

1.模型生長情況：荷瘤兔腫瘤生長情況：本實驗中采用了切開植入法和穿刺針植入法建立荷瘤兔，結果發現約3周后切開植入法腫瘤接種成功率為100%(5/5)，穿刺針植入法接種成功率為60%(3/5)，后者相同時間內瘤體較前者小。乳腺癌轉移淋巴結模型生長情況：移植后1～2周即可于左側胸壁第3乳頭處觸及腫瘤組織塊，活動度差，類圓形，約2周內增長速度較慢，3～4周增長速度明顯加快，成瘤率為93.3%(14/15)，瘤體大體觀見圖1A。約6周實驗兔觸及淋巴結，經過組織病理學檢查，證實9只實驗兔淋巴結為轉移性，轉移率為64.3%(9/14)，轉移淋巴結大體觀見圖2A。

2.超聲表現：腫瘤超聲表現：左側胸壁第 3 乳頭處可探及類圓形低回聲結節，邊界尚清，內回聲不均，彩色多普勒血流顯像示腫瘤周邊可見較豐富彩流信號(圖1B)。彈性成像示腫瘤整體較軟，若中央出現壞死，壞死附近較硬(圖1C)。超聲造影示腫瘤呈向心性不均勻增強，部分可見充盈缺損(圖1D)。轉移淋巴結超聲表現：轉移淋巴結呈類圓形或橢圓形低回聲，淋巴門結構消失或移位，彩色多普勒血流顯像示周邊可見點棒狀彩流信號(圖2B)。彈性成像示淋巴結較軟(圖2C)。超聲造影示整體呈不均勻增強，部分可見充盈缺損(圖2D)。

3.組織病理學結果：移植瘤呈類圓形，血供較豐富，切開后顯示腫瘤呈白色“魚肉樣”，質地較軟，部分可見液化壞死。HE染色可見腫瘤細胞體積增大，胞質豐富，淡紅染色，核膜不規則，核異型性明顯，核大深染，核質比明顯增大，核仁可見，核分裂象多見(圖1E)。轉移性淋巴結見大量癌細胞巢，癌細胞體積大，核大深染，淋巴結的正常結構被破壞(圖2E)。

圖2 轉移淋巴結表現

討 論

乳腺癌是目前威脅女性健康最常見的惡性腫瘤，且有趨于年輕化的趨勢，一旦發生轉移，預后明顯變差[2]。淋巴結轉移是最常見的轉移途徑，因此腋窩淋巴結狀態及其治療十分重要。有關乳腺癌轉移淋巴結部分實驗不適合在人體內進行研究，因此相關動物模型的建立是乳腺癌轉移淋巴結研究的重要內容，可靠的評價方法也具有重要意義。

VX2 腫瘤細胞株起源于 shope 病毒誘發的兔乳頭狀瘤衍生的鱗癌，它的高存活率使它們成為體內接種的合適候選者[3]。該模型已用于子宮、舌頭、胃、下咽、乳房、直腸、肌肉、面頰、肝臟和肺在內的各種部位兔腫瘤模型的建立，極易淋巴結轉移[4]。移植性乳腺癌模型是應用最廣的，移植方法包括細胞懸液注射法，組織塊懸液接種法以及腫瘤組織塊接種法，國內外研究證實，組織塊接種法易發生淋巴結及多器官的轉移，可能的原因是組織塊小，瘤細胞能獲得充分的營養和氧氣供應，腫瘤細胞的濃度可以抵抗免疫屏障，延緩清除過程，保證腫瘤細胞的正常生長[5]。本研究利用腫瘤組織塊接種法建立乳腺癌轉移淋巴結模型，因VX2腫瘤組織極易在肌層生長，所以利用少量腫瘤組織在荷瘤兔大腿肌層生長出大量腫瘤組織后再進行后續研究[6]。針對組織塊接種法建立荷瘤兔，部分研究采用切口植入法，部分研究利用18G穿刺針將瘤粒植入特定部位[5,7]。本研究比較了上述兩種方法，發現前者成瘤率更高，腫瘤生長得更快、更大，更適合用于建立實驗兔，可能的原因是切口植入法可以肉眼準確地觀察到瘤體是否種植于特定部位，且瘤體生長空間較穿刺針植入法更大。

超聲具有實時簡便、安全無創的優點，已被廣泛應用于乳腺癌及轉移淋巴結的診斷。隨著各種超聲新技術的發展和應用，超聲檢查在乳腺癌及轉移淋巴結的診斷中扮演著越來越重要的角色[8]。二維超聲可以觀察移植瘤和轉移淋巴結邊界、形態、直徑、內部回聲、有無壞死及淋巴結淋巴門有無受侵犯等，彩色多普勒可以反映移植瘤及轉移淋巴結血流豐富程度及分布特征。人乳腺癌超聲多表現為不均勻低回聲結節，形態不規則，邊界不清，轉移淋巴結淋巴門結構不清，彩流集中在周邊。本研究實驗兔瘤體隨著時間的延長體積逐漸增大，表現為低回聲結節，邊界尚清，內部回聲從不均勻到出現液化壞死，彩流開始稀疏而后逐漸增多，轉移淋巴結隨時間延長逐漸增大，淋巴門結構不清，部分伴液化壞死，彩流分布于周邊。該模型乳腺癌、轉移淋巴結二維及彩色多普勒超聲表現與人類似。

超聲彈性成像是一種對組織硬度敏感的成像技術，利用特定病理或生理過程引起的軟組織彈性變化，使組織硬度的定量評估成為可能[9]。根據彈性模式圖彩色編碼分為3型：1型為藍色或藍綠色(硬度較大)，2型為綠色或黃綠色(中等硬度)，3型為紅色或橙紅色(硬度較小)[10]。人乳腺癌及轉移淋巴結彈性成像均提示較硬，本模型乳腺癌及轉移淋巴結彈性成像均提示較軟，該特征與人乳腺癌及轉移淋巴結存在差異的原因可能與VX2腫瘤本身質地較軟的特征相關[11]。超聲造影是一種使用微泡造影劑提供組織血流實時信息的安全且容易獲得的技術[12]。氣泡極大地影響超聲后向散射，增加血管對比度，進而明顯提高超聲診斷的分辨力、敏感度和特異性[13]。人乳腺癌及轉移淋巴結超聲造影均表現為向心性不均勻增強，部分可見灌注缺損，本模型乳腺癌及轉移淋巴結超聲造影表現與人一致[11]。

本研究采用組織包埋法制備兔乳腺癌轉移淋巴結模型，雖然部分超聲特征與人存在差異，但該模型仍存在如下優點：①成瘤率為93.3%，轉移率為64.3%，成瘤率高，較易轉移；②兔的組織病理學特征與人類相似，在兔身上的研究可以更好地擴展到人類[5];③瘤體及轉移淋巴結較表淺，易于各種超聲技術觀察;④較易飼養，存活率及存活時間較長，便于實驗觀察。

本實驗利用切開植入法成功建立乳腺癌轉移淋巴結模型，常見超聲技術能便捷地探查移植瘤及轉移淋巴結的生長特征及變化過程，可用于乳腺癌轉移淋巴結各種實驗研究。