T淋巴細胞亞群在膿毒癥患者中的表達特點及預后的研究

黃守秋 陳曉兵 李 帆 孫 艷 王言理 孫 文 李小民

膿毒癥是機體對各種原因引起的反應失調并伴發多臟器衰竭的一組臨床綜合征，具有高發生率、高病死率、進展速度快等特點，也是導致各大ICU除心源性疾病外患者死亡的重要原因之一[1，2]。膿毒癥的發病機制復雜，其中以炎性因子風暴及免疫紊亂為熱點。當病原微生物入侵時，機體會啟動固有免疫和適應性免疫系統，中性粒細胞聚集，分泌炎性介質發揮抗炎作用，同時激活T淋巴細胞發揮免疫功能，調動機體的免疫防御機制[3]。近年來有研究發現，膿毒癥發生時T細胞發揮重要作用，其中CD4+T細胞亞群占絕大多數，而發揮重要作用主要是其亞群調節性T細胞(regulatory T cell,Treg)。Treg通過釋放TGF-β、IL-10等細胞因子抑制自身反應性T細胞增殖活化，也可通過抑制CD4+T細胞，從而破壞T淋巴細胞和B淋巴細胞來發揮免疫無能和免疫抑制作用。輔助性T細胞17(T helper cell 17,Th17)有募集中性粒細胞的功能，分泌IL-17、IL-22、IL-6、TNF-α參與多種炎性反應和免疫性疾病，同時與Treg相互作用，從而維持Th17/Treg的平衡狀態[4]。本研究通過研究膿毒癥患者T淋巴細胞亞群的分布，以及Th17和Treg細胞及其比值來判斷膿毒癥的嚴重程度及預后。

對象與方法

1.對象：選取徐州醫科大學附屬連云港醫院2020年12月～2021年10月收治的63例成年膿毒癥患者作為研究對象，最終納入50例膿毒癥患者，患者年齡18～90歲，其中根據膿毒癥患者的28天預后，分為存活組(n=33)和死亡組(n=17)。根據收縮壓<90mmHg，血乳酸≥2mmol/L或使用血管活性藥物，分為膿毒癥組(n=15)和膿毒性休克組(n=35)。納入標準：①年齡≥18歲；②符合膿毒癥的診斷標準Sepsis 3.0，即感染+SOFA評分≥2[1,2]。排除標準：①拒絕參加及不符合標準的血樣本；②懷孕、哺乳期女性；③24h內死亡或自動出院患者；④資料不完整者；⑤患自身免疫病、腫瘤、HIV及乙型肝炎患者；⑥近3個月使用免疫制劑及激素。本研究經徐州醫科大學附屬連云港醫院醫學倫理學委員會批準(倫理審批號：KY2020030402)。

2.收集指標和診斷標準：收集入院患者年齡、性別、感染部位、意識、血壓、呼吸、脈率、心率、24h內降鈣素原(PCT)、C反應蛋白(CRP)、白細胞計數、中性粒細胞計數、淋巴細胞計數、血細胞比容、血紅蛋白、血小板計數、肌酐、白蛋白、膽紅素、血乳酸(Lac)、血pH值、Na+、K+，計算中性粒細胞/淋巴細胞比值(NLR)、血小板/淋巴細胞比值(PLR)、系統免疫炎癥指數(SII)、急性生理學與慢性健康狀況評分系統Ⅱ(APACHEⅡ)評分、序貫器官衰竭評分(SOFA評分)，使用流式測定Treg、Th17并計算Th17/Treg。

3.方法：采集入組患者的外周血3ml，采用羅氏診斷血氣分析儀及配套試劑測定血乳酸水平；采用邁瑞全自動血液分析及配套試劑測定白細胞計數、淋巴細胞計數、中性粒細胞計數、血小板計數以及CRP，并計算NLR、PLR和SII；采用邁瑞儀器使用金標法檢測PCT；采用美國BD公司的FACS CantoTMⅡ流式細胞儀檢測Treg、Th17。

結 果

1.不同預后的膿毒癥患者的一般臨床資料比較：兩組患者年齡、血紅蛋白、白蛋白、APACHEⅡ評分比較，差異均無統計學意義(P>0.05)，死亡組SOFA評分明顯高于存活組，差異有統計學意義(P<0.05)。兩組患者年齡、性別、感染部位(肺部感染、消化道感染、泌尿道感染、膽道感染、腹腔感染、血源性感染、其他)比較，差異均無統計學意義(P>0.05)，死亡組膿毒性休克患者人數所占比例明顯高于存活組，差異有統計學意義(P<0.05)。兩組患者Lac、CRP、白細胞計數、中性粒細胞計數、血小板計數、Treg比較，差異均無統計學意義(P>0.05)，死亡組NLR、PLR、SII、PCT、Th17、Th17/Treg明顯高于存活組，淋巴細胞計數明顯低于存活組，差異均有統計學意義(P<0.05)，詳見表1。

表1 兩組患者一般臨床資料比較

2.不同預后患者有意義指標的水平分布情況: 膿毒癥發生時，NLR、PLR、SOFA評分常用于判斷疾病的預后，在以28天死亡為結局時，通過圖1和圖2的箱形圖分析，可以看出膿毒癥患者中的存活組和死亡組的NLR、PLR、SII、Th17/Treg、SOFA評分進行組間比較，死亡組均高于存活組，且結合單因素分析，差異均有統計學意義(P<0.05)。

圖1 兩組患者各指標水平分布

圖2 兩組患者SOFA評分的比較

3.膿毒癥患者和膿毒性休克患者相關指標比較：兩組患者28天病死率結果顯示，膿毒性休克組高于膿毒癥組，差異有統計學意義(P<0.05)。兩組患者Th17、Treg比較，差異均無統計學意義(P>0.05)，膿毒性休克組CD3+CD4+T細胞、CD3+CD8+T細胞、Th17/Treg明顯高于膿毒癥組，差異均有統計學意義(P<0.05)，詳見表2。

表2 兩組患者相關指標比較[n(%),M(Q1,Q3)]

4.影響膿毒癥患者28天病死率的Logistic回歸分析：兩組影響膿毒癥患者28天死亡Logistic回歸分析結果顯示，NLR、SOFA評分、Th17/Treg在模型中比較，差異均有統計學意義(P<0.05)，且均為影響患者死亡的危險因素，詳見表3。

表3 影響膿毒癥患者28天預后的Logistic回歸

5.NLR、SOFA評分、Th17/Treg評估膿毒癥患者28天預后的ROC曲線：NLR、SOFA評分、Th17/Treg評估膿毒癥患者28天死亡AUC分別為0.749、0.776、0.834，且對應P值均<0.05，說明各指標評估膿毒癥患者28天病死率的價值均有統計學意義，詳見表4、圖3。

圖3 各指標診斷膿毒癥患者28天預后的ROC曲線

表4 NLR、SOFA評分、Th17/Treg診斷膿毒癥患者28天預后的ROC曲線

討 論

膿毒癥發病機制復雜,目前免疫炎性反應紊亂是其關鍵之一[5,6]。NLR是一種成本低、簡便、快速的新型炎性指標。膿毒癥發生時，中性粒細胞可以發揮如殺滅細菌、真菌、病毒等病原微生物的重要作用，機體啟動防御機制，釋放相關炎性介質激活淋巴細胞發揮免疫作用[7]。本研究NLR AUC為0.749(P=0.004)，最佳截斷值為27.295，敏感度為64.7%，特異性為90.9%。相關研究表明NLR與危重病患者病死率密切相關，與膿毒癥的病情及預后相關，該結論與本研究結果一致[8，9]。Hwang等[10]研究發現，急診入院時膿毒癥患者的NLR與28天病死率相關，NLR的變化可能被證明是一種有價值的預后標志物。Liu等[11]通過對333 例成年膿毒癥患者進行前瞻性隊列研究發現，NLR水平升高與膿毒癥患者的不良預后獨立相關。而在一項關于老年膿毒癥患者的研究中NLR的AUC為0.689(P=0.012)，最佳截斷值為11.82，敏感度為66.67%，特異性為67.74%[12]。

1994年，歐洲重癥監護醫學協會(ESICM)提出SOFA評分系統，Vincent等[13]回顧性分析了1643例感染患者最初24h的SOFA評分，結果表明，SOFA評分與病死率有很好的相關性。SOFA評分作為一種公認的預測器官功能的量表，常常被用來預測膿毒癥的預后，并在預測膿毒癥的病死率中具有較好的預測能力[1,14]。Li等[15]進行的一項回顧性研究中顯示，生存組和死亡組的SOFA評分比較，差異有統計學意義，死亡組在第28天SOFA評分明顯高于存活組，ROC下28天 SOFA評分為0.661，即SOFA評分與快速序貫器官衰竭(qSOFA)評分和邏輯器官功能障礙系統(LODS)兩評分系統相比較，SOFA評分在預測膿毒癥患者的預后方面更優越，這一結果與本研究相似，SOFA評分閾值為12.5，AUC為0.776，敏感度為58.8%，特異性為87.9%。

在獲得性免疫中，T淋巴細胞因數量多發揮著重要作用。T淋巴細胞亞群包括CD3+CD4+T細胞、CD3+CD8+T細胞，在某種程度上T淋巴細胞的計數反映機體的免疫狀態，通過本研究發現，CD4+T、CD8+T細胞在膿毒癥休克組中的數量高于膿毒癥組。在T淋巴細胞亞群中研究最多的是CD4+T淋巴細胞亞群的Th17和Treg。Th17主要分泌IL-17、IL-22等細胞因子參與促炎反應，而Treg主要釋放IL-10、TGF-β發揮免疫抑制和免疫無能，Th17/Treg平衡在細胞免疫中發揮重要作用[16]。Th17與Treg并非單一通過其各亞群絕對數來代表機體免疫情況，Th17/Treg比例的失衡也與膿毒癥的預后存在明顯的相關性。Gupta等[17]通過比較創傷后膿毒癥患者的Treg變化結果發現，膿毒癥休克患者的Th17/Treg比值較單純膿毒癥患者的高，同時其比例與序貫器官衰竭評分也呈強正相關，表明Th17/Treg比例越高，SOFA評分數值越高，膿毒癥患者的預后越差[17]。當機體發生膿毒癥時，機體處于代償狀態，Th17、Treg均會有升高，主要是Treg，后期病情加重，處于免疫抑制狀態，兩者仍升高，以Th17為主[21]。有研究顯示，膿毒癥患者中Th17/Treg隨著膿毒癥嚴重程度失衡而進一步加重[18]。本研究顯示，Th17/Treg的ROC值為0.834，閾值為0.116，敏感度為82.4%，特異性為85.8%。

目前，膿毒癥的預測指標有很多，臨床上常將血培養作為其金標準，具有耗費時間長、陽性率低、易出現假陽性的缺點，不易對早期膿毒癥做出干預以及改善預后。有研究表明，Th17/Treg的比例失衡與膿毒癥的嚴重程度有關，這與本研究結果基本一致，膿毒癥休克組患者T淋巴細胞亞群及Th17/Treg較膿毒癥組高，當Th17/Treg>0.116，膿毒癥患者病情越重，預后越差[19]。

本研究具有一定的局限性：①該研究為小樣本量的前瞻性實驗，需要開展大樣本量的研究進行驗證；②數據在收集過程中存在缺失的可能，進行入組時會有選擇偏倚;③早期診斷膿毒癥困難，用流式檢測對標本要求較高。

綜上所述，本研究結果顯示，NLR、SOFA評分、Th17/Treg是膿毒癥患者28天預后的影響因素，且Th17/Treg與患者病情嚴重程度及預后有關，可以作為研究膿毒癥治療和判斷預后的指標。