ELISA法測定水產苗種中孔雀石綠及其代謝物的殘留量

梁 娟，張倩玉，魏海英，于盟盟，牟丹丹，王 磊

(日照市海洋與漁業研究院，山東 日照 276826)

孔雀石綠(Malachite green，MG)是一種人工合成的有機化合物，它既是染料，也是殺菌劑[1]，在治理魚卵中霉菌和殺滅魚體寄生蟲以及防治魚類水霉病、爛鰓病等方面效果顯著[2-3]，也曾被廣泛應用于蝦卵、蟹卵中寄生蟲和真菌的治療與預防。孔雀石綠進入生物體后，絕大部分通過生物轉化代謝為脂溶性隱色孔雀石綠(Leucomalachite green，LMG)并能夠穩定地殘留在魚類等水產品的脂肪組織中[4]。經研究證明，MG/LMG具有致癌、致畸和致突變等毒副作用[1-5]，已被大多數國家明令禁止在人類可食用的動物源性食品中使用。《中華人民共和國農業農村部公告 第250號》文件中規定，MG/LMG在所有食品動物中禁止檢出。但由于MG/LMG價格低廉、療效好，相關理想的替代藥品尚未出現，導致在水產育苗、養殖中其被非法使用的情況屢禁不止，因此通過對苗種中MG/LMG的檢測，可以從水產養殖源頭上監控水產品的質量安全。

目前，水產品中MG/LMG的檢測方法有GB/T 19857—2005、GB/T 20361—2006、SN/T 1768—2006、SC/T 3021—2004等標準方法，但截至目前，針對水產苗種中MG/LMG殘留量的檢測，國家相關部門尚未發布國家標準、行業標準等標準方法。2007年10月9日，山東省質量技術監督局發布地方標準DB37/T 713—2007《水產苗種魚藥殘留限量》，其中規定的方法是大型儀器分析方法——高效液相色譜法。大型儀器分析方法雖然靈敏度高、準確性好，常作為MG/LMG殘留檢測的確認方法，然而水產苗種的繁育周期短、季節性強，若抽檢樣品用大型精密儀器進行檢測，受限于檢測技術復雜、前處理過程耗時長、檢測結果滯后等原因，當陽性樣品檢測結果上報給漁業主管部門時，苗種已被銷售。這種情況不但貽誤最佳執法時機，而且容易使含有MG/LMG的陽性樣品流向養殖環節，從源頭就出現水產品質量安全隱患。因此，在實際檢測工作中，建立靈敏度高、特異性強、快速簡便的ELISA法具有重要意義，可以為漁業質量安全主管部門的管理工作提供及時的技術支撐，提高執法工作的時效性。

目前檢測水產苗種中MG/LMG殘留量的主要方法有氣相色譜-質譜法(GC-MS)[6]、高效液相色譜法(HPLC)[7-8]、高效液相色譜-熒光檢測法(HPLC-FLD)[9]、高效液相色譜-質譜法(HPLC-MS)[10]、高效液相色譜—串聯質譜法(HPLC-MS/MS)[4，11-12]、超高效液相色譜-串聯質譜法(UPLC-MS/MS)[3，13-15]、免疫膠體金法(GICT)[5]等。本文參照GB/T 19857—2005[16]《水產品中孔雀石綠和結晶紫殘留量的測定》對美國柏爾生物技術公司提供的試劑盒使用方法進行優化改進，以期建立對不同基質水產苗種中MG/LMG殘留量進行定性、定量測定的ELISA分析方法，為基層檢測人員降低檢測結果的假陽性率和假陰性率以及提高其可靠性提供建議。

1 材料與方法

1.1 儀器和試劑

MK3微孔板酶標儀，賽默飛世爾科技(中國)有限公司；微量移液器、多道微量移液器，賽默飛世爾科技(中國)有限公司；PL202-L電子精密天平，梅特勒托利多儀器上海有限公司；TG16-WS2臺式高速離心機，湖南湘儀實驗儀器開發有限公司；渦旋混合器，美國Talboys公司；KQ-5200DE超聲波清洗器，昆山超聲儀器有限公司；DC-24水浴氮吹儀，上海安譜實驗科技股份有限公司；10D經濟型純水儀，上海摩勒科學儀器有限公司；DNP-9002BS-III電熱恒溫培養箱，上海新苗醫療器械制造有限公司；BCD-215KS海爾電冰箱，青島海爾股份有限公司；-10～50℃、10%～90%RH溫濕度表，北京康威儀表有限責任公司；JYL-C022九陽料理機，九陽股份有限公司；96孔MG/LMG檢測試劑盒，美國柏爾生物技術公司；去離子水；分析純乙腈，上海國藥集團化學試劑有限公司；分析純正己烷，天津科密歐試劑有限公司。

1.2 樣品

試驗所用樣品為國家北方蝦蟹產業技術體系日照站、山東省現代農業刺參產業技術體系日照綜合試驗站和山東省現代農業魚類產業技術體系日照東港綜合試驗站等產業技術體系試驗站提供的中國對蝦(Penaeuschinensis)、三疣梭子蟹(Portunustrituberculatus)、刺參(Stichopusjaponicus)、牙鲆(Paralichthysolivaceus)等不同基質苗種樣品，以及取自日照市轄區內經濟技術開發區、東港區、嵐山區等各區縣風險監測樣品。

1.3 方法

1.3.1 試劑配制

取100 μL 10×濃縮氧化劑(Oxidant solution)液加入到900 μL乙腈中，按9∶1比例稀釋為1×Oxidant Solution；將提取物A (Concentrate of extraction buffer A)固體濃縮袋用少量純水超聲振蕩至完全溶解，然后轉移至100 mL容量瓶中，用純水定容，配制成1×Extraction buffer A concentrate；取1 mL 10×濃縮樣品提取液B(Sample extraction buffer B)加入到9 mL純水中，按9∶1比例稀釋為1×Sample extraction buffer B；取10 mL 10×濃縮樣品提取液C(Sample extraction buffer C)加入到90 mL純水中，按9∶1比例稀釋為1×Sample extraction buffer C；將正己烷加入純水，超聲振蕩混合均勻，制備飽和正己烷；取10 mL 20×濃縮洗液(Wash solution)加入到190 mL純水中，按1∶19比例配制1×Wash solution；取100 μL 100×MG-生物素耦合物(MG-Biotin conjugate)加入到9.9 mL MG-生物素耦合物稀釋液(MG-Biotin conjugate Diluent)中，按1∶99比例配制成10 mL 1×MG-Biotin conjugate工作液；取100 μL 100×辣根過氧化物酶標記的鏈親和素(Streptavidin-HRP)加入到9.9 mL辣根過氧化物酶標記的鏈親和素稀釋液(Streptavidin-HRP diluent)中，按1∶99比例配制成10 mL 1×Streptavidin-HRP工作液。為保證檢測結果的準確性和可靠性，以上試劑，除1×Extraction buffer A concentrate可在室溫(22.5±2.5)℃下長期保存外，其余試劑均需現用現配。

1.3.2 樣品處理

挑出樣品中餌料等雜質，用去離子水清洗、瀝干，攪碎成糜狀，充分混合均勻；準確稱取(2.00±0.01)g樣品置于25 mL聚丙烯離心管中，依次加入1 mL 1×Concentrate of extraction buffer A、0.4 mL 1×Sample extraction buffer B和6 mL乙腈，超聲振蕩20 min，在室溫(22.5±2.5)℃ 條件下4 000 r/min離心10 min；取10 mL聚丙烯離心管，并在管中加入300 mg(±40 mg)純化試劑(MG clean up mix)；移取2 mL乙腈上清液置于該離心管中，以最大轉速渦旋振蕩1 min后，在室溫(22.5±2.5)℃條件下靜置10 min；(22.5±2.5)℃、4 000 r/min離心10 min；移取1 mL上清液置于另一個10 mL聚丙烯離心管中，50～60℃水浴氮氣吹干。加入100 μL 1×Oxidant solution，最大轉速渦旋振蕩1 min；(22.5±2.5)℃、4 000 r/min離心1 min，靜置15 min；依次加入400 μL 1×Sample extraction buffer C和650 μL飽和正己烷，最大轉速渦旋振蕩1 min，(22.5±2.5)℃、4 000 r/min離心5 min；去除上層正己烷，下層溶液供酶標板進行檢測。

1.3.3 酶聯免疫反應

移取標準溶液或樣品上機液90 μL，置于對應的酶標板孔中；再按以上順序加入30 μL 1×MG-Biotin conjugate，輕輕振蕩混勻1 min，用蓋板膜蓋板后，在室溫(22.5±2.5)℃條件下孵育30 min；小心揭開蓋板膜，將孔內液體甩干，每孔加入洗滌液250 μL，輕輕振蕩混勻1 min，將孔內液體甩干，重復洗板步驟3次，每次間隔10 s，在吸水紙上倒扣、排干，排干后若有氣泡，先用洗耳球吹破，再拍干；每孔加入100 μL 1×Streptavidin-HRP，輕輕振蕩混勻1 min，用蓋板膜蓋板后，在室溫(22.5±2.5)℃條件下孵育15 min；再按照上述方法洗板3次；每孔加入100 μL底物(TMB substrate)，輕輕振蕩混勻1 min，用蓋板膜蓋板后，在室溫(22.5±2.5)℃條件下孵育15～20 min；每孔加入100 μL終止液終止反應，輕輕振蕩混勻1 min，供上機測定(在上機前30～40 min打開酶標儀，以使儀器狀態穩定，并將測試波長設定為450 nm)。

2 結果與分析

2.1 超聲振蕩試驗

選取中國對蝦、三疣梭子蟹、刺參、牙鲆4種不同基質的MG/LMG陰性樣品，每種基質樣品分別稱取相同10份，均添加為1.00 μg·kg-1加標水平，每2份為一組，設5個平行組，在固定超聲頻率為40 kHz的試驗條件下，分別超聲振蕩10、15、20、25、30 min，以考察超聲振蕩時間對MG/LMG檢出水平和樣品乳化現象的影響(表1)。試驗結果顯示，在10～20 min范圍內，MG/LMG檢出水平隨著時間的延長而提高，樣品提取液狀態良好，未出現混濁和乳化現象；20 min之后，樣品提取液開始出現混濁和乳化現象，且MG/LMG檢出水平降低，這可能是多次使用正己烷去乳化層引起MG/LMG損失所致。由此可見，超聲振蕩適用于MG/LMG的提取，且最佳時間為20 min。

表1 超聲振蕩時間對樣品檢出水平和乳化現象的影響

2.2 靜置時間驗證

樣品加入乙腈超聲振蕩后，過快收集容易同時收集含有少量水滴的乙腈[11]，使氮吹操作困難，濃縮時間增加；靜置時間過長，易產生乳化、乳化層含水量高等不利后續試驗進行的情況[15]。本文對65份不同基質樣品進行陽性篩選，以驗證靜置時間對后續試驗的影響：相對于靜置10 min，靜置5 min氮吹時間延長；靜置15 min氮吹時間與其相差不大，但有些樣品開始出現乳化現象，可能是樣品中溶于乙腈的雜質析出所致。由驗證結果可知，本方法的最佳靜置分層時間為10 min。

2.3 線性范圍與檢出限

本文采用0、0.050 0、0.150、0.500、1.50、4.50 ng·mL-16個濃度梯度建立標準曲線，相關系數R2=0.997 0，樣品稀釋倍數為1.5倍，故將0.075 μg·kg-1定為本方法的最低檢出限。與國家標準推薦的HPLC法[17]和LC-MS/MS法[16]相比，ELISA法檢出限較低、靈敏度較高(表2)，在0.050 0～4.50 ng·mL-1水平范圍內，標準曲線線性關系良好(表3)，可以對樣本中MG/LMG的殘留定量測定。由此可知，采用ELISA法作為MG/LMG監控技術手段具有可行性。

表2 ELISA法和大型儀器分析法的檢出限與定量限

表3 ELISA法和大型儀器分析法的線性范圍

2.4 加標回收率與精密度(RSD)

同大型儀器分析法的自動進樣方式不同，ELISA法是手動進樣。正確把握可調試移液器“吸二打一”的操作手法[18]是減少偶然誤差、增加微量進樣穩定性和確保RSD的有效方法。對于食品中禁用藥物，回收率應在方法檢測下限、兩倍方法檢測下限和十倍方法檢測下限進行加標回收率試驗[19]。不同種類的樣品之間性質差異很大，會導致不同的基質效應，而基質效應對反應的干擾是影響ELISA法檢測結果準確性的重要因素。樣品中的雜蛋白、脂肪、色素等物質會影響抗體與抗原的結合，降低方法靈敏度與穩定性，甚至導致檢測結果的假陽性或假陰性。本方法選取4種不同基質的MG/LMG陰性樣品，分別做0.075、0.150、0.750 μg·kg-13個加標水平的檢測，每個加標水平設6組重復，3個加標水平回收率均在79.7%～104.5%之間，RSD測定范圍為3.3%～7.9%(表4)。相對刺參苗種，三疣梭子蟹、牙鲆、中國對蝦等苗種可能分別由于蟹殼、魚骨、蝦殼等不可食部分的影響，使樣品空白的檢出水平偏高，導致3個加標水平的平均回收率均較低，但4種不同基質樣品的回收率和RSD均符合漁業主管部門的質量控制規定。由此可見，本文所建立的方法具有良好的準確度和RSD，適用于不同基質水產苗種中MG/LMG殘留量的測定。

表4 不同基質、不同加標水平回收率和RSD(n=6)

2.5 正己烷試驗

為證明飽和正己烷的提取效果，分別用正己烷試劑與飽和正己烷做除脂凈化試驗，中國對蝦、三疣梭子蟹、刺參、牙鲆等苗種各稱取6份，均添加1.00 μg·kg-1加標水平，方式設3組重復，分別計算平均檢出水平。結果顯示，對于同一苗種，用飽和正己烷去脂的樣品檢出濃度較高(表5)，因此用純水對正己烷試劑進行飽和具有必要性。

表5 正己烷試劑與飽和正己烷去脂MG/LMG檢出水平比對

3 討論

3.1 提取劑的選擇

分析水產品中MG/LMG常用的提取溶劑為乙腈、甲醇、乙醇、戊醇，白志榮等[10]、宋凱等[13]均發現甲醇、乙醇、戊醇等醇類與水的互溶性較強，會將水產品中部分水溶性蛋白提取出來，帶來更多雜質，使提取溶液渾濁，不利于后續凈化；GB/T 19857—2005[16]《水產品中孔雀石綠和結晶紫殘留量的測定》規定提取劑為乙腈；宮向紅等[7]研究表明乙腈有利于沉淀蛋白，有一定的凈化作用。故本方法選取乙腈為提取溶劑。

3.2 渦旋振蕩的優化改進

胡萍等[8]發現采用超聲波振蕩提取相比渦旋混合器與傳統的搖床，更能均質充分與提取完全，可提高反應體系對MG/LMG的結合，同時還有樣品反應同步、準確度提高等優點。但是，超聲提取時間過短容易混合不勻、提取不充分，造成假陰性；隨著超聲提取時間的延長，樣品中MG/LMG的提取效率有所增加[20]，同時也會溶解出更多的雜質成分造成乳化現象。因此，把握好超聲振蕩時間是操作的關鍵。在實際檢測工作中，一般將20個樣品作為同一批次進行檢測，每個樣品需要渦旋振蕩提取4 min，共需80 min。本方法依據GB/T 19857—2005優化為超聲振蕩提取，該種方式20 min即可完成，使提取時間縮短、工作效率提高，故本方法將渦旋振蕩提取優化為超聲振蕩提取。

3.3 靜置時間對樣品濃縮的影響

水產育苗用水中藻類較多、水質黏性大，苗種體表清洗不徹底以及MG/LMG具有很強的親脂性[14]等原因，導致樣品加入1×Concentrate of extraction buffer A和1×Sample extraction buffer B振蕩混合時容易形成共軛現象，靜置時乳化現象嚴重，分層不明顯，不利于MG/LMG的提取。用乙腈作為提取劑，可以減輕乳化現象。對于如何達到更好的防乳化效果，關鍵應把握好乙腈加入之后的最佳靜置分層時間。

3.4 記號筆的優化改進

MG/LMG是常用的三苯甲烷類工業染料，被廣泛應用于紡織印染、油墨、涂料中，大部分黑色記號筆油墨中含有MG/LMG[14]。在檢測過程中用該顏色記號筆進行標記，會因油墨中MG/LMG的遷移和滲透特性，使樣品呈現假陽性。本文對65份不同基質樣品進行陽性篩選，篩選過程中離心管用黑色記號筆進行標記，其中有6份樣品結果呈現假陽性，假陽率達到9.2%。針對篩選出的假陽性樣品，改用紅色記號筆對離心管進行標記，用本文建立的ELISA法進行檢測，結果為陰性，后續又用LC-MS/MS法對其結果進行確證，結果均為陰性。綜上所述，選用紅色記號筆對離心管進行標記，可以最大限度地排除黑色記號筆中油墨的干擾，提高檢測結果的準確性和可靠性。

3.5 正己烷的優化改進

農業部1192號公告-1-2009《水產苗種違禁藥物抽檢技術規范》[21]規定，苗種樣品的制備應整尾/只絞碎混合均勻。動物源食品中肝臟基質復雜、脂肪含量高，再加上雜蛋白、色素等雜質的干擾，提取液極易產生乳化現象。當乳化現象嚴重到一次不能徹底去除時，需要增加正己烷的去脂次數。但多次去脂會造成MG的損失，使得樣品檢出水平降低，容易導致樣品的假陰性。本方法將正己烷優化為純水飽和正己烷，可以在有效去除乳化層的基礎上，減少MG的損失，確保方法的靈敏度和檢測結果的準確性。

4 結論

本文采取了超聲振蕩提取、飽和正己烷去乳化層以及用紅色記號筆對離心管標記等優化措施，建立了對不同基質水產苗種中MG/LMG殘留量進行定性、定量測定的ELISA分析方法。通過檢測實際樣品進行驗證，4種不同基質樣品(中國對蝦、三疣梭子蟹、刺參、牙鲆等苗種)中MG含量在0.050 0～4.50 ng·mL-1范圍內呈現良好的線性關系，相關系數R2=0.997 0，方法檢出限為0.075 0 μg·kg-1。在0.075 0、0.150、0.750 μg·kg-1的加標水平下，平均回收率為79.7%～104.5%，RSD為3.3%～7.9%，由此可知優化措施具有可行性。與大型儀器分析方法相比，ELISA法還具備分析成本低、操作步驟簡單、有機試劑使用量少、對人體傷害和環境污染危險性小等優點，是目前水產苗種中較為理想的應急篩查和常規檢測方法[22]。通過多年實際檢測結果可知，用本方法檢出的陽性樣品，后續再用GC-MS/MS法進行對其確證，檢測結果二者一致。因此，本方法可用于實際樣品的檢測，能夠較好地滿足水產苗種質量安全監管部門的需要。