羅湖病毒(TiLV)RT-qPCR方法的建立

徐淑菲，朱黃鑫，曾韻穎，劉啟霖，方成俊，林雙慶，孔凡德*

(1.廈門海關(guān)技術(shù)中心，福建 廈門361026；2.東山海關(guān)綜合技術(shù)服務(wù)中心，福建 漳州363401)

羅非魚是很多發(fā)展中國家的主要食用蛋白質(zhì)來源，也是許多漁民和養(yǎng)殖者的重要經(jīng)濟來源，是全球養(yǎng)殖產(chǎn)量最高的單一品種。羅非魚養(yǎng)殖已成為保障全球糧食安全和滿足人類營養(yǎng)需求的重要產(chǎn)業(yè)，從20世紀(jì)50年代開始，我國羅非魚養(yǎng)殖已經(jīng)形成苗種繁育、養(yǎng)殖生產(chǎn)、加工出口相對完整的產(chǎn)業(yè)鏈，成為全球最大的羅非魚養(yǎng)殖國家。但是我國養(yǎng)殖羅非魚主要以小養(yǎng)殖戶為單位[1]，高溫高密度精養(yǎng)池塘經(jīng)常發(fā)生大面積疾病。雷燕等[2]2017年報道了國內(nèi)養(yǎng)殖羅非魚首次檢出羅湖病毒(Tilapia lake virus，TiLV)，引起了國內(nèi)相關(guān)部門的重視，但未見官方報道。

TiLV是2012年Eyngor M等[3]首次發(fā)現(xiàn)的危害羅非魚的一種新型的RNA病毒，由10個獨特的基因片段組成，直徑55～75 nm，目前仍未確定其分類地位，但極有可能隸屬于正黏病毒科，與流感病毒同屬一科。2018年Senapin S等[4]從無明顯臨床癥狀、無死亡的成年羅非魚和魚苗中檢測出TiLV，提示TiLV可能像傳染性鮭貧血病毒(ISAV)一樣存在著變異株。

國外已經(jīng)在病毒的細胞培養(yǎng)、組織病理學(xué)、RT-PCR、nested RT-PCR、semi-nested RT-PCR、SYBR quantitative RT-PCR、原位雜交等檢測技術(shù)方面進行了研究，并建立了相應(yīng)的檢測方法。因為分子生物學(xué)方法具有快速、靈敏、簡便的特點，大多數(shù)國家都采用其對TiLV進行監(jiān)測和診斷。現(xiàn)有檢測TiLV的分子生物學(xué)方法大多是針對假設(shè)蛋白基因片段而建立，如Tsofack J K等[5]根據(jù)基因片段3(Genebank序列號KJ605629)建立了巢氏RT-PCR方法；Dong H T等[6]建立的半巢氏RT-PCR方法也是根據(jù)片段3建立的；Pitchaporn W等[7]建立的實時熒光定量RT-PCR(Reverse transcription-quantitative real-time PCR，RT-qPCR)方法根據(jù)片段3設(shè)計引物探針，GenBank序列號為KU751816.1、MF574205.1、MF582636.1、MF502419.1、KX631923.1；劉助紅等[8]同樣是根據(jù)基因片段3(Genebank序列號KJ605629)建立了RT-LAMP方法。TiLV基因片段3編碼假設(shè)蛋白，基因片段1編碼RNA聚合酶，目前已有大量關(guān)于基因片段3的研究論文，但通過基因片段1進行檢測的研究論文很少。本研究根據(jù)TiLV基因片段1的保守序列設(shè)計3套特異性引物和探針，并探討建立RT-qPCR方法的可行性，為進一步監(jiān)控及預(yù)防TiLV提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品的采集和處理

采集羅非魚成魚的肝、脾、腎和腦組織，并于-80℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 主要試劑和儀器

主要試劑：MagSi Total RNA Kit，OMEGA公司產(chǎn)品，貨號M7930-02；QuantiNova Probe RT-PCR Kit，QIAGEN公司產(chǎn)品，貨號為208354，包括2×Probe RT-PCR Master Mix、QN Probe RT-Mix、RNase-free water。

主要儀器：熒光定量PCR儀(德國耶拿，型號qTOWER3G)、磁珠純化系統(tǒng)(杭州奧盛，型號Auto-Pure32A)、臺式冷凍離心機(Beckman公司，型號Allegra64R)。

1.1.3 引物

檢測TiLV的RT-qPCR的引物和探針：

引物TiLV-qF：5’-CCCACTTACACAACGAGGAATGA-3’(5 μmol/L)；

引物TiLV-qR：5’-GGTGGCAATCCCAAGTCAGTAG-3’(5 μmol/L)；

探針TiLV-qP：VIC-CTCCCCACATGCCTG-MGB(5 μmol/L)。

1.1.4 擴增片段基因序列(97 bp)

擴增片段基因序：cccacttacacaacgaggaatgaggacttcctccccacatgcctgggagggaagactgtaattagctttcaatctctact gacttgggattgccacc。

合成的TiLV的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒和慢病毒序列相同(976 bp)，均包含該97 bp擴增片段基因序列。

1.1.5 反應(yīng)體系

若無特殊說明，均按照表1反應(yīng)體系進行試驗。

表1 反應(yīng)體系

1.1.6 反應(yīng)條件

反應(yīng)條件：反轉(zhuǎn)錄45℃ 20 min；預(yù)變性95℃ 5 min；擴增95℃ 15 s，退火延伸溫度 1 min，40個循環(huán)。熒光收集設(shè)置在退火延伸時進行。若無特殊說明，均按照此反應(yīng)條件進行試驗。

1.1.7 核酸濃度

本文使用到的核酸濃度：TiLV質(zhì)粒，5 ng/μL；TiLV慢病毒，25 ng/μL。

1.2 方法

1.2.1 RNA的提取

按照MagSi Total RNA Kit操作說明書進行RNA提取。

1.2.2 檢測TiLV的RT-qPCR方法的建立及優(yōu)化

1)檢測TiLV的RT-qPCR的引物、探針的最佳濃度研究

將原始濃度為5 μmol/L的探針TiLV-qP、原始濃度為10 μmol/L的引物TiLV-qF和TiLV-qR，分別進行10倍梯度稀釋。

A組：6個熒光定量PCR管中均加入使用濃度為5 μmol/L的探針TiLV-qP 1 μL(對應(yīng)的終濃度0.25 μmol/L)，A1～A6管分別加入使用濃度分別為10、5、2.5、1.25、0.625、0.312 5 μmol/L的引物TiLV-qF和TiLV-qR各1 μL(對應(yīng)的終濃度分別為0.5、0.25、0.125、0.062 5、0.031 25、0.015 625 μmol/L)；B組：6個熒光定量PCR管中均加入使用濃度為2.5 μmol/L 的探針TiLV-qP 1 μL(對應(yīng)的終濃度為0.125 μmol/L)，B1～B6管分別加入使用濃度分別為10、5、2.5、1.25、0.625、0.312 5 μmol/L的引物TiLV-qF和TiLV-qR各1 μL；C組：6個熒光定量PCR管中均加入使用濃度為1.25 μmol/L 的探針TiLV-qP 1μL(對應(yīng)的終濃度為0.062 5 μmol/L)，C1～C6管分別加入使用濃度分別為10、5、2.5、1.25、0.625、0.312 5 μmol/L的引物TiLV-qF和TiLV-qR各1 μL；D組：6個熒光定量PCR管中均加入使用濃度為0.625 μmol/L 的探針TiLV-qP 1 μL(對應(yīng)的終濃度為0.031 25 μmol/L)，D1～D6管分別加入使用濃度分別為10、5、2.5、1.25、0.625、0.312 5 μmol/L的引物TiLV-qF和TiLV-qR各1 μL(表2)。反應(yīng)條件按照1.1.6進行。

表2 檢測TiLV的RT-qPCR的引物探針最佳濃度各組分情況表

2)檢測TiLV的RT-qPCR方法的最佳退火溫度和重復(fù)性研究

將原始濃度為5 μg/mL的TiLV質(zhì)粒進行10倍梯度稀釋，依次為5×10-2～5×10-7μg/mL。除了模板外，其他按照優(yōu)選的反應(yīng)體系配制試劑，將按梯度稀釋的TiLV質(zhì)粒分裝到6組(每組重復(fù)3次)共18個熒光PCR反應(yīng)管中。

第1組至第6組的熒光PCR反應(yīng)管分別加入5×10-2～5×10-7ng/μL梯度稀釋的TiLV質(zhì)粒各1 μL。第1～6組分別按照退火溫度50、55、60、65、70℃進行RT-qPCR。反應(yīng)條件：反轉(zhuǎn)錄45℃ 20 min；預(yù)變性95℃ 5 min；擴增95℃ 15 s，退火延伸溫度分別為50、55、60、65、70℃1 min，40個循環(huán)。熒光收集設(shè)置在50、55、60、65、70℃退火延伸時進行。

1.2.3 繪制檢測TiLV的RT-qPCR方法的標(biāo)準(zhǔn)曲線

除模板按照優(yōu)選的反應(yīng)體系配制試劑外，其余將原始濃度為5 μg/mL的TiLV質(zhì)粒進行10倍梯度稀釋，分別為5×10-1～5×10-6μg/mL，并分裝到6組(每組重復(fù)4次)共24個熒光PCR反應(yīng)管中，添加體積為1 μL。反應(yīng)條件按照1.1.6(其中，退火延伸溫度根據(jù)1.2.2試驗獲得)進行。最后繪制檢測TiLV的RT-qPCR方法的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.4 檢測TiLV的RT-qPCR方法的靈敏度試驗

除了模板按照優(yōu)選的反應(yīng)體系配制試劑外，其余將原始濃度為5 μg/mL的TiLV質(zhì)粒進行10倍梯度稀釋，分別為5×10-1～5×10-8μg/mL，平均分裝到8個熒光PCR反應(yīng)管中，添加體積為1 μL(TiLV質(zhì)粒終濃度分別為2.5×10-2～2.5×10-9ng/μL)。反應(yīng)條件按照1.1.6(其中，退火延伸溫度根據(jù)1.2.2試驗獲得)進行。

1.2.5 檢測TiLV的RT-qPCR方法的特異性試驗

按照優(yōu)選的反應(yīng)體系(模板除外)配制試劑，平均分裝到13個熒光PCR反應(yīng)管中，第1～13管分別加入TiLV質(zhì)粒、TiLV慢病毒、真鯛虹彩病毒(RSIV)、錦鯉皰疹病毒(KHV)、流行性造血器官壞死病毒(EHNV)、金魚造血器官壞死病毒(GFHNV)、流行性潰瘍綜合征(EUS)、鯉春病毒血癥病毒(SVCV)、傳染性造血器官壞死病毒(IHNV)、傳染性鮭魚貧血病(ISA)、鮭魚甲病毒(SAV)、病毒性出血性敗血癥(VHSV)、RNase-free water各1 μL。反應(yīng)條件按照1.1.6(其中，退火延伸溫度根據(jù)1.2.2試驗獲得)進行。

1.2.6 應(yīng)用

將建立的檢測TiLV的RT-qPCR方法應(yīng)用于300份羅非魚、石斑魚等樣品的TiLV的檢測。羅非魚臨床樣品從福建省養(yǎng)殖場采集，包括詔安縣梅川雙田水庫養(yǎng)殖場、漳州市常山基祥水產(chǎn)養(yǎng)殖場、詔安縣紅坑水庫養(yǎng)殖場、福建銘興食品冷凍有限公司四都水庫養(yǎng)殖場、三姑娘水庫養(yǎng)殖場、嶺下溪水庫養(yǎng)殖場、石厝底水庫養(yǎng)殖場、梅州水庫養(yǎng)殖場。石斑魚樣品來自本實驗室日常檢疫留樣。

2 結(jié)果與分析

2.1 檢測TiLV的RT-qPCR方法的優(yōu)化

優(yōu)化結(jié)果見圖1、2。正常Ct值的范圍是15～35，本組試驗結(jié)果表明，第A至D組分別對應(yīng)圖1-A至圖1-D。圖1-A的TiLV-qP終濃度為0.5 μmol/L時，擴增靈敏度最高，且Ct值在正常范圍內(nèi)，因此優(yōu)選圖1-A；A圖中A1、A2 Ct值均為20.5，A3 Ct值為21.2，選擇Ct值更小的A1、A2；擴增曲線A2的引物濃度更低，從節(jié)省試劑角度考慮，優(yōu)選擴增曲線A2。因此最佳的引物TiLV-qF、TiLV-qR、探針TiLV-qP終濃度均為0.25 μmol/L(對應(yīng)的使用濃度均為5 μmol/L)。

注：A～C的TiLV-qP終濃度分別為0.25、0.125、0.062 5、0.031 25 μmol/L(對應(yīng)的使用濃度分別為5、2.5、1.25、0.625 μmol/L) ；A1～A6、B1～ B6、C1～C6、D1～ D6的 TiLV-qF/qR終濃度分別為0.5、0.25、0.125、0.062 5、0.031 25、0.015 625 μmol/L(對應(yīng)的使用濃度分別為10、5、2.5、1.25、0.625、0.312 5 μmol/L)。

圖2試驗結(jié)果顯示，退火溫度55～60℃，同等核酸濃度擴增曲線Ct值基本一致，且重復(fù)性好；退火溫度65～70℃，靈敏度降低。通常熒光PCR退火溫度選擇60℃，因此本RT-qPCR最佳退火溫度選擇60℃，且重復(fù)性好。

注：A～E的退火溫度分別為50、55、60、65、70℃。1～6代表加入反應(yīng)體系中的質(zhì)粒初始濃度(5×10-1～5×10-6 ng/μL)。

2.2 檢測TiLV的RT-qPCR方法的標(biāo)準(zhǔn)曲線

繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線結(jié)果見圖3。圖3顯示R2為0.997 45，PCR擴增效率為0.91，擴增效果極好，說明此引物探針的設(shè)計和濃度比例以及反應(yīng)條件均最佳，可用于樣品中TiLV的絕對定量分析。

注：1～6的TiLV質(zhì)粒終濃度分別為2.5×10-2～2.5×10-7 ng/μL(對應(yīng)的質(zhì)粒使用濃度為5×10-1～5×10-6 ng/μL)。

2.3 檢測TiLV的RT-qPCR方法的靈敏度分析

靈敏度分析結(jié)果見圖4。圖4試驗結(jié)果顯示，本文建立的檢測TiLV的RT-qPCR方法可檢測至第7管，TiLV核酸終濃度為2.5×10-8ng/μL，靈敏度為2.5×10-8ng/μL。

注：1～8的TiLV質(zhì)粒終濃度分別為2.5×10-2～2.5×10-9ng/μL(對應(yīng)的使用濃度分別為5×10-1～5×10-8 ng/μL)。

2.4 檢測TiLV的RT-qPCR方法的特異性分析

特異性結(jié)果見圖5。試驗結(jié)果顯示本文建立的檢測TiLV的RT-qPCR方法只能擴增出TiLV質(zhì)粒和TiLV慢病毒，其他常見的水生動物病毒均無擴增曲線，說明該方法特異性好。

注：1.TiLV質(zhì)粒；2.TiLV慢病毒；3.真鯛虹彩病毒(RSIV)；4.錦鯉皰疹病毒(KHV)；5.流行性造血器官壞死病毒(EHNV)；6.金魚造血器官壞死病毒(GFHNV)；7.流行性潰瘍綜合征(EUS)；8.鯉春病毒血癥病毒(SVCV)；9.傳染性造血器官壞死病毒(IHNV)；10.傳染性鮭魚貧血病(ISA)；11.鮭魚甲病毒(SAV)；12.病毒性出血性敗血癥(VHSV)；13.陰性對照。

2.5 檢測TiLV的RT-qPCR方法的驗證與應(yīng)用

將本試驗建立的檢測TiLV的RT-qPCR方法應(yīng)用于300份日常檢測樣品及水庫樣品的檢測，結(jié)果均未檢出TiLV。 并采用本團隊建立的同時檢測TiLV和病毒性神經(jīng)壞死病毒(Viral nervous necrosis virus，VNNV)的雙重RT-PCR方法和檢測TiLV的RT-LAMP方法進行驗證，顯示三種方法對所有樣品的檢測結(jié)果均一致，均未檢出TiLV。

3 討論

3.1 TiLV基因分析

TiLV共10個基因片段，基因片段1編碼RNA聚合酶，基因片段2～10編碼假設(shè)蛋白，與以往的蛋白沒有相似性，因此其功能不明確[7]。目前本研究團隊從Genbank中查詢到31個TiLV病毒毒株的基因片段1的序列，包括毒株TH-2013、TH-2014、TH-2015、TH-2016-CN、TH-2016-CU、TH-2017、TH-2018-K、TH-2018-N、TH-2019、BD-2017、BD-2017-181、BD-2019-E3、BD-2019-E1、WVL18053-01A、WVL19031-01A、WVL19054、CL、F3-4、TV1、TV2、TV3、TV4、TV5、TV6、TV7、Til-4-2011(基因片段1的GenBank登錄號：NC_029926、KU751814)、NBC02、NBC03、NBC04、NBC06、EC-2012)。本文根據(jù)基因片段1的保守序列，設(shè)計3套引物和探針，并從中優(yōu)選出引物和探針的最佳濃度。

3.2 國內(nèi)TiLV監(jiān)測情況

全國水產(chǎn)技術(shù)推廣總站每年都進行TiLV的專項檢測工作，海關(guān)系統(tǒng)也有TiLV的專項監(jiān)測任務(wù)，本實驗室參與了福建省水產(chǎn)技術(shù)推廣總站采樣和病毒檢測工作，至今未檢出一例，其他地區(qū)也未有報道。

本實驗室自2017年就開始收集羅非魚樣品，至今已收集300多份，利用本文建立的RT-qPCR方法檢測，結(jié)果均為陰性。但這并不能說該方法無效，綜合文獻報道及每年海關(guān)、水產(chǎn)技術(shù)推廣站的監(jiān)測結(jié)果，研究團隊認為目前國內(nèi)羅非魚感染TiLV的可能性極低，但監(jiān)控預(yù)防工作不可松懈。

4 結(jié)論

本文建立了檢測TiLV的RT-qPCR方法，優(yōu)化的20 μL反應(yīng)體系包括：2×Probe RT-PCR Master Mix 10 μL，QN Probe RT-Mix 0.2 μL，5 μmol/L的引物TiLV-qF、TiLV-qR、探針TiLV-qP各1 μL，模板1 μL，補充RNase-free water至20 μL；優(yōu)化的反應(yīng)條件：反轉(zhuǎn)錄45℃ 20 min；預(yù)變性95℃ 5 min；擴增95℃ 15 s，60℃ 1 min，40個循環(huán)；熒光收集設(shè)置在60℃退火延伸時進行。該方法能夠檢測出TiLV質(zhì)粒和TiLV慢病毒，對其他病毒無擴增條帶，說明方法特異性好，靈敏度為2.5×10-8ng/μL。