紅比利時杜鵑愈傷懸浮顆粒瞬時轉化體系構建及植株再生

何 凡 吳月燕 謝曉鴻 楊國霞 蔣寶鑫 李東賓 鄢毅鋮 賈永紅,*

(1 浙江萬里學院生物與環境學院，浙江 寧波 315100；2 寧波市林場，浙江 寧波 315440)

杜鵑花(Rhododendron)是一種常見的灌木或喬木類園藝觀賞花卉，其形態多樣、花色繁多、花期較長，廣泛用于環境綠化和室內美化，具有很高的觀賞價值與經濟價值。我國杜鵑花種類豐富，據統計，目前我國擁有600多種，占世界杜鵑花種類總量的半數以上[1-2]。但是，我國的杜鵑花多為野生原種，經過馴化或改造而適于室內栽培的杜鵑花品種較少。目前國內市場上大量銷售的杜鵑花園藝栽培品種如比利時、東洋等，多是引自歐洲或日本的品種。同時，由于生態環境惡化，局部地區棲息的野生杜鵑花也面臨生存挑戰[3]。據《杜鵑花紅色名錄》[4]報告，我國受不同等級威脅的杜鵑花種類有213種，占總數的32.03%，表明我國杜鵑花的生存狀態岌岌可危[5]。因此，加強我國杜鵑花遺傳資源保護與開發利用研究迫在眉睫。

目前，我國杜鵑花研究主要集中于苗木栽培、雜交育種、生理生化指標測定等領域[6]，而在亞細胞結構闡述、關鍵功能基因挖掘、遺傳轉化體系構建、信號轉導通路探索等領域的研究較少，表型發生分子機制的解析也需要深入探索。遺傳轉化系統作為開展功能基因組學、分子育種、生物反應器等研究的關鍵技術之一，在促進基因功能研究領域的深入發展方面具有重要作用。特別是近年來，瞬時轉化體系以其高效、快捷的優勢日益被用于開展基因功能驗證及組織定位、基因沉默[7-9]、蛋白互作等研究[10-14]，并在快速重組蛋白生產方面顯示出重要的應用價值[15]。

自從Rossi等[16]于1993年在煙草中首次成功建立農桿菌介導的瞬時轉化技術以來，該技術目前已成功應用于多種植物，模式植物如擬南芥[17]、番茄[18]，農作物如水稻[19]，木本植物如蘋果[20]、板栗[21]，以及草本植物如草莓[22]、苜蓿[23]等。杜鵑花作為一種重要的木本園藝植物，其瞬時轉化仍鮮有報道。

紅比利時杜鵑花(Rhododendron×hybridumHort)是皋月杜鵑(Rhododendronindicum)、映山紅(R.simsii)及毛白杜鵑(R.mucronatum)等經長期、反復雜交而育成的一種園藝花卉新品種。該品種花色艷麗、顏色多樣，花期長，具有較高的經濟價值。然而，紅比利時杜鵑花生長緩慢、適應性不強，一定程度制約了該品種的廣泛種植。鑒于此，本研究以寧波市地域特色杜鵑花園藝品種紅比利時為研究對象，開展愈傷誘導、愈傷增殖、愈傷懸浮顆粒培養等研究，建立以愈傷懸浮顆粒為受體的農桿菌瞬時轉化體系，并通過植物組織細胞工程技術，獲得再生植株，以期為開展包括該品種在內的杜鵑花生物學性狀發生與調控、分子育種、基因編輯等理論研究，以及提高杜鵑花經濟附加值的實踐應用研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料及前處理

紅比利時杜鵑花嫩葉取自寧波北侖萬景杜鵑良種園。從多株生長旺盛、無病害的3歲齡杜鵑花頂部分枝采集長(1.0～1.5)cm×寬(0.5～1.0)cm的嫩葉，無菌水沖洗葉片表面浮塵后放入冰盒帶回浙江萬里學院植物生理與分子改良實驗室，參照何凡等[26]的方法進行前處理：少量清潔劑清洗嫩葉表面臟污后將其轉入干凈的廣口瓶中并置于自來水細流下緩慢沖洗30 min左右。之后用無菌鑷子將沖洗完成的嫩葉外植體轉移至無菌玻璃瓶中，在滅菌的超凈工作臺上用適量70%酒精浸洗嫩葉約30 s，倒出酒精并用無菌水清洗1次。瀝干無菌水，將0.1%的HgCl2溶液倒入玻璃瓶中消毒嫩葉約5 min，同時輕輕搖晃玻璃瓶，使外植體與HgCl2溶液充分接觸，隨后用無菌水浸泡清洗4～5遍。使用無菌鑷子取出嫩葉放置于滅菌的干燥濾紙上，待水分吸干后，用滅菌剪刀將嫩葉剪成約1 cm2的小塊，用無菌鑷子將小塊嫩葉外植體接種至培養基。

1.2 菌株、試劑與儀器

菌株：大腸桿菌DH5α，寶日醫生物技術(北京)有限公司；農桿菌GV3101、pCAMBIA1301-CFP，上海唯地生物技術有限公司；pRI 101-AN，浙江萬里學院李旭博士后饋贈。

試劑：木本植物培養基(woody plant medium，WPM)、植物組培抗菌劑(plant preservative mixture，PPM)，美國Phytotech公司；噻重氮苯基脲(thidiazuron，TDZ)、6-芐基腺嘌呤(benzyladenine，6-BA)、2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-dichlorophenoxyacetic acid，2,4-D)、萘乙酸(1-naphthaleneacetic acid, NAA)、玉米素(zeatin, ZT)、激動素(kinetin, KT)，北京索萊寶科技有限公司；其余常規生化試劑均來自寧波奧博生化試劑公司。

主要儀器與設備：5804R高速冷凍離心機，德國艾本德中國有限公司；RZX型智能人工氣候箱，寧波江南儀器有限公司；ZQZY-78BN震蕩培養箱，上海知楚儀器有限公司；LSM980激光共聚焦顯微鏡，德國卡爾蔡司股份公司；DN300雙目生物顯微鏡，寧波永新光學股份有限公司；超凈工作臺，力康精密科技(上海)有限公司。其余常規設備來自海門市其林貝爾儀器制造有限公司。

1.3 愈傷誘導的生長調節劑組合試驗

以2.41 g·L-1WPM+ 20 g·L-1蔗糖+ 10 g·L-1麥芽糖+ 7.0 g·L-1瓊脂為基本培養基，以2,4-D的4個濃度(0.1、0.2、0.3、0.4 mg·L-1)和TDZ的4個濃度(0.1、0.2、0.3、0.4 mg·L-1)按照濃度梯度一一對應的方式設定4個組合，將完成前處理的嫩葉分別接種到4組培養瓶中，每組接30瓶，共120瓶。接種后的培養瓶先在暗箱中培養7 d，然后將其轉移到溫度25±2℃、 光照強度1 500 lx、光照16 h/黑暗8 h的條件下繼續培養，每7 d觀察外植體的形態變化并及時清理發生污染、褐化、死亡的組培瓶。49 d后統計外植體的變化情況，以外植體正常愈化的數量占總接種數量的比例計算誘導率，依據試驗結果確定生長調節劑的最優濃度組合。

1.4 愈傷增殖的響應面試驗

把誘導獲得的愈傷組織切割成小塊，將其接種到繼代培養基中作增殖培養。以2.41 g·L-1WPM + 20 g·L-1蔗糖 + 10 g·L-1麥芽糖 +7.0 g·L-1瓊脂為基本培養基，借助Expert-Designer 10.0軟件中Box-Behnken響應面法設計如下試驗：以2,4-D(mg·L-1，X1)、6-BA(mg·L-1，X2)、TDZ(mg·L-1，X3)為自變量，以培養30 d后愈傷組織鮮重的增加值占最初接種愈傷組織塊鮮重的百分比，即增殖率(%，Y)為響應值，設計三因素三水平試驗(表1)，確定繼代培養過程中愈傷組織增長最快的生長調節劑最優濃度組合。

表1 愈傷組織繼代增殖的Box-Behnken響應面法試驗設計Table 1 Experimental design of Box-Behnken response surface method for callus subculture and proliferation

1.5 愈傷顆粒懸浮培養

在生長調節劑最優濃度組合條件下，選取繼代培養5～7次的顆粒狀愈傷組織5 g，將其接種到約100 mL液體繼代培養基中(培養基方案為響應面試驗優化后的結果)，在溫度25±2℃、光照強度1 500 lx、光照16 h/黑暗8 h、轉速120 r·min-1的條件下繼續培養，2～3周后，用40目的無菌細胞篩濾除大組織塊，將篩選出的愈傷組織小顆粒分作2～3瓶，置于相同液體培養基并在相同條件下繼續培養，重復上述步驟，最終獲得批量愈傷顆粒懸浮液。

1.6 愈傷顆粒懸浮液的理化特性測定

在愈傷顆粒懸浮液制備過程中，稱取2 g愈傷懸浮顆粒，接種到40 mL液體培養基中，重復30瓶，在同樣培養條件下連續震蕩培養20 d，期間每隔2 d隨機取出3瓶測定如下指標：用pH計測量濾液的pH值；用電導率儀檢測電導率；過濾溶液得到愈傷組織顆粒，將顆粒于60℃烘干2 h，之后稱其干重，依據接種前后質量變化繪制生長曲線。

1.7 GUS染色

采用熱激法將含有GUS(β-葡萄糖苷酸醇，β-glucuronidase)基因的pRI 101-AN質粒轉入活化的農桿菌GV3101，經菌液培養、抗性篩選后，挑取陽性克隆接種于農桿菌培養基(yeast extract beef, YEB)液體培養基中，經擴增、離心等步驟獲得含有pRI 101-AN的農桿菌。對照組選用不含pRI 101-AN質粒的活化的農桿菌GV3101。用10 mmol·L-1乙-(N-嗎啉)乙磺酸，[2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid, MES](pH值5.6)+10 mmol·L-1MgCl2+200 mmol·L-1乙酰丁香酮(acelosyringone, AS)的混合液重懸農桿菌，調節OD600為0.4、0.6、0.8、1.0，備用。準備生長狀態良好的紅比利時杜鵑花愈傷顆粒懸浮液3份，靜置，去上清，將準備好的農桿菌侵染液與愈傷顆粒混合，分別侵染15、20、30、40 min后，棄上清，在下層顆粒中加入5 mL WPM液體培養基，輕輕混勻后，1 650 r·min-1室溫離心3 min，獲得沉淀物，洗滌重復3次；將洗滌后的懸浮顆粒接入新的WPM培養液，于30℃避光條件下，130 r·min-1搖床培養1 d，去上清獲得侵染后的愈傷顆粒。將GUS染液與該愈傷顆粒在37℃恒溫條件下孵育40 min，之后用75%乙醇對GUS染色后的愈傷顆粒脫色，在雙目生物顯微鏡下觀察染色情況并拍照記錄。以平板中染色顆粒占全部顆粒的比例計算侵染率。

1.8 綠色熒光蛋白(green fluorescent protein, GFP)熒光試驗

參照1.7節的試驗方法及GUS染色的最佳條件，將含有pCAMBIA1301-GFP的農桿菌GV3101侵染液在OD600為0.6時侵染愈傷懸浮顆粒15 min，對照組選用不含pCAMBIA1301-GFP的GV3101侵染液。侵染后洗滌愈傷顆粒并制作制作懸浮顆粒裝片，使用激光共聚焦顯微鏡并設置藍光激發，觀察GFP的發光效果。

1.9 不定芽、不定根誘導試驗

參考前期研究結果[24]，以2.41 g·L-1WPM+7 g·L-1瓊脂+20 g·L-1蔗糖為基本培養基，添加2.0 mg·L-1TDZ與0.5 mg·L-12,4-D誘導愈傷組織不定芽。將生出不定芽的愈傷組織塊轉移到1/2 Read培養基，添加0.5 mg·L-1的吲哚丁酸(Indole-3-butyric acid，IBA)誘導生成不定根，并同時探討了IBA與NAA對生根的影響。

1.10 統計分析

采用Excel 2019處理試驗數據，以平均值±標準差(Mean ± SD)的形式表示。響應面試驗采用Expert-Designer 10.0軟件設計，方差分析采用該軟件自帶的ANOVA。折線圖采用GraphPad Prism 8.0生物統計軟件繪制，在統計結果分析中，P<0.05認為差異顯著，P<0.01 認為差異極顯著。

2 結果與分析

2.1 愈傷組織的誘導與優化方案的確定

觀察發現，嫩葉接種2 d后，嫩葉切口處由綠色變為深褐色，葉片出現彎曲(圖1-A)；14 d后嫩葉變皺，葉脈開始膨脹變大，葉片邊緣及葉脈處生出少量淡綠色愈傷組織；30 d后嫩葉四周由外向內逐步愈化生出大量愈傷組織(圖1-B～D)；49 d后整片嫩葉愈化完成(圖1-E、F)。生長調節劑組合誘導嫩葉的愈化率統計結果見表2。依據愈化率及愈傷生長勢，確定紅比利時杜鵑花嫩葉的適宜誘導方案為：在2.41 g·L-1WPM+20 g·L-1蔗糖+10 g·L-1麥芽糖+7 g·L-1瓊脂+0.050 mg·L-1PPM抗菌劑的基本培養基中，加入0.3 mg·L-12,4-D+0.3 mg·L-1TDZ，此條件下的愈化率可達97.78%。

表2 愈傷誘導的生長調節劑組合設計方案與結果Table 2 Combination design and experiment result of growth regulators for callus induction

注：A：嫩葉接種；B～D：愈傷分化過程；E、F：致密型愈傷組織；G、H：繼代5次后的疏松型愈傷組織。Note：A: Young leaves inoculation. B～D: Callus differentiation process. E、F: Compact callus. G、H: Loose callus after subculture for 5 times.圖1 嫩葉愈傷組織誘導及繼代Fig.1 Callus induction and subculture of young leaves

2.2 愈傷增殖的響應面試驗

2.2.1 愈傷增殖的響應面試驗結果 設定2,4-D(mg·L-1，X1)、6-BA(mg·L-1，X2)和TDZ(mg·L-1，X3)的三因素三水平試驗，測定愈傷組織的增殖率，響應面試驗結果如表3所示。對結果進行回歸擬合分析，得到各參數之間的二次多項式回歸模型：

Y=164.53+2.67X1+13.23X2+24.26X3+5.91X1X2+0.11X1X3+8.58X2X3-90.86X12-63.56X22-32.33X32。

2.2.3 最佳提取工藝參數的預測及試驗驗證 取X1、X2、X3中任意2個變量，愈傷增殖率受其中2個變量交互作用的影響結果如圖3所示。結果表明，曲面受TDZ變化的曲折程度大于6-BA和2,4-D。通過二次模型所得到的等高線圖和響應曲面可知，3種激素之間的交互作用較強。由圖2-A可知，激素TDZ曲線面最陡，說明激素TDZ對愈傷增殖的影響最大。各激素交互作用明顯，均呈曲線，有明顯峰值，說明增殖率隨3種激素濃度的增加先升高后降低，且有明顯的最佳值。

表3 愈傷組織增殖的Box-Behnken響應面試驗結果Table 3 Box Behnken response surface experiment results of callus proliferation

表4 愈傷組織增殖的響應面二次回歸方程模型方差分析Table 4 Analysis of variance of response surface quadratic regression equation model for callus proliferation

綜上分析，愈傷組織最優增殖效果的生長激素配比方案為：0.61 mg·L-12,4-D+0.65 mg·L-16-BA+1.57 mg·L-1TDZ，理論預測增殖率高達170.19%。采用優化后的方案進行愈傷組織增殖檢驗，實際測得增殖率約為167%，比軟件理論預測值170.19%約小3個百分點。

圖2 響應面試驗結果Fig.2 Results of response surface experimental

圖3 愈傷顆粒懸浮培養的接種(A)和持續增殖(B、C)及最終結果(D)Fig.3 Inoculation (A) and continuous proliferation (B, C) of callus suspension culture and results (D)

2.3 愈傷顆粒懸浮培養物建立及理化特性

將繼代5次獲得的愈傷顆粒經細胞篩過濾后所得的小顆粒(圖1-G、H)接種于2.41 g·L-1WPM+20 g·L-1蔗糖+10 g·L-1麥芽糖+0.61 mg·L-12,4-D+0.65 mg·L-16-BA+1.57 mg·L-1TDZ的液體培養基中震蕩培養(圖3-A)，每7 d換一次新的培養液，期間肉眼可見愈傷顆粒數量不斷增加(圖3-A～C)，30 d后愈傷顆粒懸浮培養結果如圖3-D所示。在培養過程中，3種理化指標檢測結果表明，pH值呈現先降低后升高的趨勢(圖4-A)；溶液電導率總體呈現下降趨勢(圖4-B)，這種反向相關性可能與不斷消耗的離子和持續生成的代謝物有關。懸浮顆粒在第4至第12天期間呈現指數生長，最高增幅可達45%(圖4-C)。

2.4 GUS染色試驗

染色試驗結果表明，對照組愈傷顆粒未被染色(圖5-A、B)，而成功轉化pRI101-AN質粒的愈傷顆粒呈現出GUS染色效果(圖5-C、D)。以愈傷顆粒GUS染色為指標，評價愈傷顆粒在不同濃度侵染液、侵染不同時間下的侵染率，結果表明，OD600為0.6的農桿菌在侵染15 min時效果最好，侵染率為26.28%(表5)，此時GUS染色效果如圖5-C、D所示。

2.5 GFP熒光試驗

GFP熒光試驗結果表明，對照組未檢測到熒光(圖6-A)，試驗組檢測到多個GFP熒光斑塊(圖6-B，藍色箭頭所示)。當含有pCAMBIAB01-GFP的農桿菌侵染愈傷顆粒時，因侵染效果不同與瞬時轉化效率差異，愈傷懸浮顆粒出現GFP熒光斑彩。

圖4 愈傷顆粒培養過程中pH值的變化(A)、電導率的變化(B)和生長曲線(C)Fig.4 Changes of pH value (A), conductivity (B) and growth curve (C) during callus culture

2.6 不定根、不定芽誘導結果

誘導結果表明，將不定芽接種至1/2 Read培養基中(圖7-A、B)，培養40 d后長出不定根(圖7-C、D)，直至長成試管苗(圖7-E、F)。同時，參考前期研究方法[24]，通過比較IBA與NAA對生根效果的影響，結果同樣發現IBA和NAA均可誘導根的分化，但NAA誘導的根細短且易脫落，而IBA誘導的根長勢較快且健壯。隨著IBA和NAA生長調節劑濃度的增加，生根率降低。當IBA含量為0.5 mg·L-1、NAA含量為0 mg·L-1時，生根率最高，統計結果顯示為20.16%±0.71%。由此表明，IBA有利于根的分化；生根的最適培養基為1/2 Read+0.5 mg·L-1IBA。

圖5 GUS染色的對照組(A、B)與試驗組(C、D)愈傷懸浮顆粒Fig.5 Control group(A、B) and experimental group(C、D) stained with GUS in callus suspension particles

表5 農桿菌侵染愈傷顆粒實驗結果Table 5 Experiment of Agrobacterium tumefaciens infecting callus particles

3 討論

瞬時轉化體系與再生系統的構建是開展基因功能研究以及構建轉基因植株的重要技術之一。本研究以嫩葉為外植體，成功構建紅比利時杜鵑愈傷顆粒瞬時轉化體系，并通過誘導愈傷組織出芽、生根，成功獲得試管苗。

圖6 GFP瞬時表達的對照組(A)和試驗組(B，藍色箭頭指示)愈傷懸浮顆粒Fig.6 Control of transient expression of callus particles (A) and GFP expression (B, indicated by blue arrow)

注：A、B為不定芽分化；C、D為不定根分化；E、F為試管苗。Note: A and B are adventitious bud differentiation. C. D are adventitious root differentiation. E. F are test tube seedling.圖7 愈傷組織不定芽、不定根的誘導Fig.7 Induction of adventitious buds and roots from callus

愈傷組織誘導是植物細胞工程研究領域中一項基礎且重要的試驗，其誘導效果受基因型、組織部位、生長調節劑種類與濃度等許多因素影響[25]。表6比較了多個不同物種的愈傷組織誘導試驗，發現常用的生長素類生長調節劑包括NAA、IBA、2,4-D，常用的細胞分裂素類生長調節劑包括6-BA、ZT、TDZ、KT。在多數試驗中，兩類生長調節劑分別選一種按“1+1”方式組合使用，如杜鵑紅山茶[26]、云錦杜鵑[27]、仙茅[28]、鳳丹牡丹[29]、郁金櫻[30]及本研究的紅比利時杜鵑等，但部分試驗采用“2+1”方式如興安杜鵑的根段[31]、甬之妃杜鵑的嫩葉[24]和杉木的針葉[32]或“1+2”方式如野生大白杜鵑的針葉、嫩葉和上胚軸等組織[33]，也有采用“2+2”的方式的如芍藥的花藥[34]。誘導結果發現，除芍藥的花藥外，其余試驗都獲得了高于60%的愈傷誘導率。本研究紅比利時杜鵑采用“1+1”組合方式，獲得了97%的愈傷誘導率。在生長調節劑濃度使用上，有“低生長素、高細胞分裂素”組合，如云錦杜鵑幼葉的“0.05+2.0”[27]、仙茅幼葉的“0.5+1.5”組合[28]；也有高生長素、低細胞分裂素組合，如甬之妃杜鵑嫩葉的“2.0+1.0”[24]、鳳丹牡丹幼胚的“2.5+0.1”[29]；還有生長素與細胞分裂素濃度近似的組合如本研究紅比利時杜鵑嫩葉的“0.3+0.3”，且都獲得了高于60%的誘導率。從上述結果看，在外植體、生長調劑種類與濃度等3個參數的選擇上，愈傷組織誘導試驗在外源生長調節劑的種類與濃度選擇上似乎沒有固定規律。1957年Skoog等[35]曾經提出一個著名的“Skoog-Miller”模式，即細胞分裂素與生長素的濃度比例會影響外植體的分化方向，比例高可誘導芽分化，比例低則誘導根分化，比例接近1則誘導愈傷組織分化。然而，本研究結果與“Skoog-Miller”模式發生矛盾，該矛盾可能因不同外植體中內源激素的種類與含量差別所導致，詳細原因有待深入研究。

表6 愈傷組織誘導試驗的生長調劑使用比較Table 6 Comparison of growth regulators used in callus induction experiment

愈傷組織增殖與愈傷組織誘導是兩個不同的生物學過程。愈傷組織誘導是體細胞去分化的試驗，涉及到體細胞中與分化有關基因的重編程，然而愈傷組織增殖是去分化后獲得的分生細胞、薄壁細胞、厚壁細胞等的增殖試驗，主要與有絲分裂有關[36]。因此，在愈傷組織誘導與愈傷組織增殖試驗中，外源生長調節劑的使用方式也不同。例如仙茅[28]幼葉愈傷組織誘導試驗的生長調劑為0.5 mg·L-1NAA + 1.5 mg·L-16-BA，而愈傷組織增殖試驗的生長調節劑為0.5 mg·L-1NAA + 2.0 mg·L-16-BA；郁金櫻[30]愈傷組織誘導試驗的生長調節劑為1.0 mg·L-12, 4-D + 0.5 mg·L-16-BA，而愈傷組織增殖試驗的生長調節劑為1.0 mg·L-16-BA，差別明顯。本研究紅比利時杜鵑愈傷組織誘導試驗的生長調節劑為0.3 mg·L-12, 4-D + 0.3 mg·L-1TDZ，而愈傷組織增殖試驗的生長調節劑為0.61 mg·L-12, 4-D + 0.65 mg·L-16-BA + 1.37 mg·L-1TDZ，兩個試驗的誘導率和增值率分別為97.78%與167%，效果均較好。

在紅比利時杜鵑愈傷組織增殖效果研究的基礎上，本研究以愈傷懸浮顆粒為受體，探討了農桿菌介導的瞬時轉化體系構建。農桿菌介導的瞬時轉化效果與菌株類型、侵染液濃度、受體類型、外界環境等諸多因素有關[12]，受到組織細胞的化學組成、結構、生理、生化、免疫等多種參數影響[37]。表7比較了幾個不同物種的瞬時轉化試驗參數，結果表明，常用的農桿菌菌株為GV3101、EHA105，侵染液OD600多數在0.6～1.0之間；受體材料多數為葉片[38]、愈傷組織[39-40]、愈傷懸浮細胞[41-42]等，只有少數使用莖段[43]或子葉節[44]的報道；報告基因通常采用GUS或GFP[38-45]。從轉化效率來看，不同的受體材料轉化效率差別較大，杜梨葉片采用GV3101的轉化效率甚至達到100%[38]。本研究針對紅比利時杜鵑瞬時轉化體系構建的參數設置與上述報道結果中的參數值相近，并獲得26.8%的轉化效率。

表7 農桿菌介導瞬時轉化試驗的部分參數比較Table 7 Comparison of some parameters of Agrobacterium mediated transient transformation experiment

再生系統的構建是植物組織工程的重要環節[6]。據不完全統計，杜鵑花屬植物的再生系統多是以頂芽、側芽或帶芽的莖段為外植體，借助直接器官誘導的方式建立的。例如，用莖尖成功繁殖的錦繡杜鵑(R.pulchrum)[46]，以頂芽繁殖的兩種西洋杜鵑栽品種(R.britannia和R.america)[47]。少數杜鵑花屬植物的再生系統是通過愈傷組織誘導，再從愈傷組織種產生不定芽的間接器官發生方式建立的。例如，目前僅發現2例以葉片為外植體誘導愈傷并培育出組培苗的研究報道，即牛皮杜鵑(R.aureum)和云錦杜鵑(R.fortunei)[48]。張開文等[6]認為，杜鵑屬植物因外植體滅菌難度大、易污染等原因導致杜鵑花愈傷組織再生相對困難，因此以間接器官發生的方式構建的再生系統較少。本研究以紅比利時嫩葉為外植體，借助響應面方法優化了生長調節劑的使用方案，高效率誘導產生愈傷組織，之后通過誘導出芽、生根，建立了紅比利時杜鵑花的間接器官發生途徑。

綜上，本研究成功構建了紅比利時杜鵑愈傷懸浮顆粒瞬時轉化體系，并實現了愈傷組織間接再生試管苗，研究結果為后續開展功能組學研究奠定了基礎。

4 結論

本研究以愈傷懸浮顆粒為受體，構建了農桿菌介導的紅比利時杜鵑瞬時轉化體系，并實現愈傷組織再生試管苗。研究發現，2,4-D和TDZ組合能高效誘導嫩葉愈化，2,4-D、6-BA和TDZ組合能促進愈傷增殖。愈傷繼代5次后可形成疏松型愈傷顆粒，經液體懸浮培養可獲得愈傷懸浮顆粒，該愈傷懸浮顆粒是農桿菌介導的瞬時轉化體系的良好受體。同時，該愈傷組織可通過間接器官發生途徑實現試管苗再生。