艾葉揮發(fā)油對(duì)H2O2誘導(dǎo)鯉魚(yú)肝臟氧化損傷的保護(hù)作用

陳劍杰 曹謹(jǐn)玲 李麗娟 張秀林 伍宜杰

(1 山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，山西 太谷 030801；2 山西農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山西 太谷 030801；3 晉中信息學(xué)院，山西 太谷 030801)

正常情況下，動(dòng)物機(jī)體具有生成和消除自由基的動(dòng)態(tài)平衡能力，當(dāng)其受到外源性或內(nèi)源性因素脅迫時(shí)，這種動(dòng)態(tài)平衡可能被打破，從而引發(fā)氧化應(yīng)激[1-2]。此時(shí)生物體內(nèi)的抗氧化系統(tǒng)會(huì)起到防御作用，其中超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)可使超氧化物陰離子(O2-) 轉(zhuǎn)化為H2O2和O2，過(guò)氧化氫酶(catalase，CAT)能很快分解H2O2，使其轉(zhuǎn)變?yōu)镠2O和O2，谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(glutathione peroxidase，GPx)可促進(jìn)H2O2的分解，而丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量可以反映機(jī)體細(xì)胞氧化損傷的程度[1]。肝臟是機(jī)體重要的代謝器官，具有解毒、防御和調(diào)節(jié)血液循環(huán)等多種作用。當(dāng)機(jī)體發(fā)生氧化應(yīng)激時(shí)會(huì)引起肝臟的氧化損傷[1-3]。因此，尋找有助于緩解機(jī)體氧化應(yīng)激的綠色安全的飼料添加劑，對(duì)預(yù)防動(dòng)物肝臟的氧化損傷以及維持其健康具有深遠(yuǎn)意義。

艾葉為菊科植物艾(Artemisiaargyi)的葉，在我國(guó)具有悠久的使用傳統(tǒng)。現(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)艾葉具有多種藥物活性作用[4-8]。艾葉揮發(fā)油(Artemisiaargyiessential oils， AAEO)是艾葉的主要有效成分。已有研究發(fā)現(xiàn)艾葉揮發(fā)油具有多種功效，如丁圓平等[9]研究發(fā)現(xiàn)艾葉揮發(fā)油能夠顯著抑制體外培養(yǎng)的人肺癌A549細(xì)胞的生長(zhǎng)且具有劑量-時(shí)間效應(yīng)，葛德鵬等[10]研究發(fā)現(xiàn)艾葉揮發(fā)油可通過(guò)破壞微生物細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)而達(dá)到抑菌效果，Xiang等[11]研究發(fā)現(xiàn)艾葉揮發(fā)油能夠?qū)瘘S色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌產(chǎn)生抑制作用，曹謹(jǐn)玲等[12]研究顯示艾葉揮發(fā)油可以通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞炎性因子的基因表達(dá)、調(diào)控細(xì)胞因子和炎癥介質(zhì)的分泌來(lái)發(fā)揮抗炎作用，齊巧明等[13]通過(guò)檢測(cè)艾葉揮發(fā)油對(duì)1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH)自由基的清除率，發(fā)現(xiàn)其具有一定的抗氧化作用。但是對(duì)于艾葉揮發(fā)油在抑制機(jī)體氧化應(yīng)激、防護(hù)肝臟氧化損傷方面的研究還鮮有報(bào)道。

過(guò)氧化氫(H2O2)極易透過(guò)細(xì)胞膜，與細(xì)胞內(nèi)鐵離子通過(guò)芬頓(Fenton)反應(yīng)形成過(guò)量的自由基，常用于體內(nèi)和體外氧化損傷模型的建造和保護(hù)劑的研究[14-15]。魚(yú)類對(duì)氧化應(yīng)激較為敏感，是研究氧化應(yīng)激的理想動(dòng)物模型[16]。鯉魚(yú)(Cyprinuscarpio)作為我國(guó)淡水水體中重要的養(yǎng)殖魚(yú)類，其綠色健康養(yǎng)殖對(duì)于經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益具有重要意義。因此，本試驗(yàn)選擇鯉魚(yú)作為受試對(duì)象，采用H2O2誘導(dǎo)鯉魚(yú)建立氧化損傷模型來(lái)探討艾葉揮發(fā)油對(duì)鯉魚(yú)肝臟氧化損傷的緩解作用，旨在為將艾葉揮發(fā)油作為綠色安全抗氧化劑以促進(jìn)魚(yú)類綠色健康養(yǎng)殖提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

150尾體型一致、健康活潑的鯉魚(yú)(平均體重為30±1.2 g)，由太原漁場(chǎng)提供，飼養(yǎng)于實(shí)驗(yàn)室養(yǎng)殖箱中；艾葉揮發(fā)油，按照《中國(guó)藥典》[17]方法進(jìn)行水蒸氣蒸餾法制備，主要成分為1,8 桉葉素(eucalyptol，2.89%)、4-萜烯醇(4-methyl-1-(1-methylethyl)-3-cyclohexen-1-ol，6.56%)、龍腦(borneol，5.94%)、松油醇(p-menth-1-en-8-ola，3.82%)、2,4,6-三甲基苯基-2,4,6-三甲基苯甲酸酯(2,4,6-trimethylphenyl-2,4,6-trimethyl benzoate，4.85%)和石竹烯(caryophyllene,5.84%)；H2O2，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；間氨基苯甲酸乙酯磺酸鹽(MS-222)，武漢中弘生物科技有限公司；考馬斯亮藍(lán)(coomassie dimethyl sulfoxide brilliant blue G-250)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(alanine aminotransferase，ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(aspartate aminotransferase，AST)、SOD、CAT、MDA、GPx試劑盒，購(gòu)自南京建成生物工程研究所；RNAiso Plus、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Green PCR kit，大連TaKaRa公司。

1.2 儀器與設(shè)備

BX53 顯微鏡成像系統(tǒng)，日本奧林巴斯；AUY-120 型電子分析天平，日本島津公司；UV2100紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，上海尤尼柯公司；MK3 酶標(biāo)儀，美國(guó)Thermo公司；TGL-10B 高速臺(tái)式離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠；XZ-0142水質(zhì)分析儀，上海希慶電子科技有限公司；熒光定量PCR儀，美國(guó)Bio-Rad公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 試驗(yàn)分組 將鯉魚(yú)隨機(jī)分為5組，分別為空白對(duì)照組、H2O2組和不同濃度AAEO試驗(yàn)組(餌料中添加AAEO的量分別為0.1、0.2、0.4 g·kg-1)，每組設(shè)3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)10尾魚(yú)。H2O2組和AAEO組每天在H2O2中暴露1 h(暴露濃度為1.00 mmol·L-1，時(shí)間為9:00—10:00)。期間按時(shí)投餌 (每天按時(shí)投喂3次，日投餌量為鯉魚(yú)體重的3%)，對(duì)照組和H2O2組投喂正常餌料，AAEO組投喂添加了相應(yīng)劑量AAEO的餌料，期間持續(xù)充氧，試驗(yàn)時(shí)間為30 d。試驗(yàn)結(jié)束后，每組隨機(jī)取15尾鯉魚(yú)(每個(gè)重復(fù)5尾)用MS-222麻醉處理，隨即進(jìn)行血液(尾靜脈采血，血液置于抗凝管中)和肝組織的采集。血液樣品進(jìn)行ALT、AST、總蛋白(total protein, TP)、白蛋白(albumin, ALB)和SOD、CAT、MDA、GPx的檢測(cè)；肝臟組織分為3部分：一部分采集后保存到-20℃冰箱中，用于SOD、CAT、MDA、GPx等抗氧化指標(biāo)的檢測(cè)；一部分采集后保存到 -80℃ 冰箱中，用于銅鋅超氧化物歧化酶(Cu/Zn-SOD)、錳超氧化物歧化酶(Mn-SOD)、GPx、CAT和核因子-E2相關(guān)因子2(Nrf2) mRNA表達(dá)檢測(cè)；其余肝組織用中性甲醛固定后用于制作常規(guī)組織切片進(jìn)行病理形態(tài)學(xué)觀察。

1.3.2 血清和組織指標(biāo)的測(cè)定 采集的血清和組織樣品，參考試劑盒使用說(shuō)明書進(jìn)行Alb、ALT、AST、TP、SOD、CAT、MDA和GPx的測(cè)定，所有指標(biāo)均于當(dāng)天測(cè)定完畢。

1.3.3 肝組織切片的制備 肝臟組織用波恩氏液固定，梯度酒精脫水二甲苯透明后石蠟包埋，切片后HE染色中性樹(shù)膠封片，并使用顯微成像系統(tǒng)觀察拍照[18]。

1.3.4 抗氧化基因mRNA表達(dá)的檢測(cè) 肝臟組織提取總RNA轉(zhuǎn)錄為cDNA，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(real-time quantitative PCR，qRT-PCR)技術(shù)對(duì)肝臟組織相關(guān)抗氧化基因Cu/Zn-SOD、Mn-SOD、GPx、CAT和Nrf2的mRNA表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)，具體操作參照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行，β-肌動(dòng)蛋白(β-actin)作為內(nèi)參基因，采用2-ΔΔct法分析目的基因mRNA相對(duì)表達(dá)量。應(yīng)用美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心(national center for biotechnology information, NCBI)數(shù)據(jù)庫(kù)查詢的基因序列，采用Premier 6軟件設(shè)計(jì)引物，見(jiàn)表1。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

采用SPSS 22.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)與分析，應(yīng)用單因素方差分析和Duncan法進(jìn)行多重比較，采用bivariate correlation進(jìn)行相關(guān)性分析。數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(Mean±SE)表示，顯著性水平為P<0.05。

表1 引物序列Table 1 Primer sequence

2 結(jié)果與分析

2.1 AAEO對(duì)H2O2暴露鯉魚(yú)血清ALT和AST活性的影響

由圖1可知，與對(duì)照組相比，H2O2組鯉魚(yú)血清ALT和AST活性均顯著升高；與H2O2組相比，不同濃度AAEO組鯉魚(yú)血清ALT和AST活性均顯著降低。相關(guān)性分析表明，AAEO添加水平與鯉魚(yú)血清ALT和AST活性均呈負(fù)相關(guān)(皮爾遜相關(guān)系數(shù)分別為 -0.597，P=0.019；-0.595，P=0.019)；且與對(duì)照組相比，0.2和0.4 g·kg-1AAEO組ALT和AST活性均無(wú)顯著差異。

注：不同小寫字母表示處理組間差異顯著(P<0.05)。下同。Note: Different lowercase letters mean significant difference among treatments at 0.05 level. The same as following.圖1 AAEO對(duì)H2O2暴露鯉魚(yú)血清ALT和AST活性的影響Fig.1 Effects of AAEO on ALT and AST activities in serum of carp exposed to H2O2

圖2 AAEO對(duì)H2O2暴露鯉魚(yú)血清TP和ALB含量的影響Fig.2 Effects of AAEO on the contents of TP and ALB in serum of carp exposed to H2O2

2.2 AAEO對(duì)H2O2暴露鯉魚(yú)血清TP和ALB含量的影響

由圖2可知，與對(duì)照組相比，H2O2組鯉魚(yú)血清TP和ALB含量均顯著降低；與H2O2組相比，0.2和0.4 g·kg-1AAEO組TP和ALB含量均顯著升高。相關(guān)性分析表明，AAEO添加水平與鯉魚(yú)血清TP和ALB含量均呈正相關(guān)(皮爾遜相關(guān)系數(shù)分別為0.589，P=0.047；0.605，P=0.017)；且與對(duì)照組相比，0.4 g·kg-1AAEO組TP和ALB含量均無(wú)顯著差異。

2.3 AAEO對(duì)H2O2暴露鯉魚(yú)血清脂質(zhì)過(guò)氧化及抗氧化能力的影響

由圖3可知，與對(duì)照組相比，H2O2組鯉魚(yú)血清MDA含量顯著升高，SOD、CAT、GPx活性均顯著降低；與H2O2組相比，AAEO組MDA含量均顯著降低。相關(guān)性分析表明，AAEO添加水平與鯉魚(yú)肝組織MDA含量呈負(fù)相關(guān)(皮爾遜相關(guān)系數(shù)為 -0.768，P=0.007)。與H2O2組相比，AAEO組SOD、CAT、GPx活性呈上升趨勢(shì)，且在0.2和0.4 g·kg-1AAEO組分別與H2O2組差異顯著。相關(guān)性分析表明，AAEO添加水平與鯉魚(yú)肝組織SOD、CAT、GPx活性呈正相關(guān)(皮爾遜相關(guān)系數(shù)分別為0.815，P=0.001；0.754，P=0.006；0.702，P=0.008)。

圖3 AAEO對(duì)H2O2暴露鯉魚(yú)血清脂質(zhì)過(guò)氧化及抗氧化能力的影響Fig.3 Effects of AAEO on lipid peroxidation and antioxidant capacity in serum of carp exposed to H2O2

圖4 AAEO對(duì)H2O2暴露鯉魚(yú)肝臟脂質(zhì)過(guò)氧化及抗氧化能力的影響Fig.4 Effects of AAEO on lipid peroxidation and antioxidant capacity of carp liver exposed to H2O2

2.4 AAEO對(duì)H2O2暴露鯉魚(yú)肝臟脂質(zhì)過(guò)氧化及抗氧化能力的影響

由圖4可知，與對(duì)照組相比，H2O2組鯉魚(yú)肝組織MDA含量顯著升高，SOD、CAT、GPx活性均顯著降低。與H2O2組相比，AAEO組MDA含量呈下降趨勢(shì)且均與H2O2組差異顯著。相關(guān)性分析表明，AAEO添加水平與鯉魚(yú)肝組織MDA含量呈負(fù)相關(guān)(皮爾遜相關(guān)系數(shù)為-0.652，P=0.008)；SOD、CAT活性呈上升趨勢(shì)且分別在0.2和0.4 g·kg-1AAEO組與H2O2組差異顯著。相關(guān)性分析表明，AAEO添加水平與鯉魚(yú)肝組織SOD、CAT、GPx活性呈正相關(guān)(皮爾遜相關(guān)系數(shù)分別為0.777，P=0.001；0.554，P=0.012；0.676，P=0.006)。

2.5 AAEO對(duì)H2O2暴露鯉魚(yú)肝臟組織結(jié)構(gòu)的影響

如圖5所示，對(duì)照組鯉魚(yú)肝臟組織結(jié)構(gòu)完整，肝細(xì)胞多呈卵圓形且邊緣清晰，肝血竇呈網(wǎng)狀分布(圖5-a)； H2O2組中，鯉魚(yú)肝臟組織出現(xiàn)病理變化，可見(jiàn)肝細(xì)胞排列嚴(yán)重紊亂，細(xì)胞邊緣不清晰，結(jié)構(gòu)表現(xiàn)異常，出現(xiàn)細(xì)胞核變形萎縮甚至消失、肝血竇增寬現(xiàn)象(圖5-b)；0.1 g·kg-1AAEO組可見(jiàn)肝細(xì)胞排列紊亂，細(xì)胞界限不清晰，出現(xiàn)細(xì)胞核變形萎縮甚至消失、肝血竇增寬現(xiàn)象(圖5-c)；0.2 g·kg-1AAEO組可見(jiàn)肝細(xì)胞排列紊亂現(xiàn)象得到緩解，出現(xiàn)肝血竇增寬現(xiàn)象(圖5-d)； 0.4 g·kg-1AAEO組可見(jiàn)肝血竇增寬現(xiàn)象明顯緩解，肝組織結(jié)構(gòu)基本正常(圖5-e)。

注:←：肝細(xì)胞,：肝血竇,?：細(xì)胞核萎縮消失；a:對(duì)照組；b:H2O2組；c:0.1 g·kg-1; d:0.2 g·kg-1; e:0.4 g·kg-1。Note: ←: Hepatocytes. : Sinusoid. ?: Nucleus atrophy disappears. a: Control group. b: H2O2 group. c:0.1 g·kg-1. d:0.2 g·kg-1. e:0.4 g·kg-1.圖5 AAEO對(duì)H2O2暴露鯉魚(yú)肝臟組織結(jié)構(gòu)的影響Fig.5 Effects of AAEO on liver tissue structure of carp exposed to H2O2

2.6 AAEO對(duì)H2O2暴露鯉魚(yú)肝相關(guān)抗氧化基因的影響

由圖6可知，與對(duì)照組相比，H2O2組鯉魚(yú)肝組織Cu/Zn-SOD、Mn-SOD、CAT、GPx和Nrf2 mRNA相關(guān)表達(dá)量分別顯著下降了34.41%、33.54%、30.52%、37.58%和35.29%；與H2O2組相比，AAEO組Cu/Zn-SOD、Mn-SOD、CAT、GPx和Nrf2 mRNA相關(guān)表達(dá)量呈上升趨勢(shì)，且0.2和0.4 g·kg-1組上升顯著。相關(guān)性分析表明，AAEO添加水平與鯉魚(yú)肝組織Cu/Zn-SOD、Mn-SOD、CAT、GPx和Nrf2 mRNA相關(guān)表達(dá)量呈正相關(guān)(皮爾遜相關(guān)系數(shù)分別為0.913，P=0.009；0.803，P=0.005；0.656，P=0.019；0.690，P=0.017；0.893，P=0.007)。

3 討論

MDA含量可反映脂質(zhì)過(guò)氧化程度，是細(xì)胞膜氧化損傷的主要指標(biāo)之一[19]。SOD、CAT和GPx是機(jī)體內(nèi)重要的抗氧化防御性功能酶，具有平衡細(xì)胞氧化還原的作用，能夠緩解細(xì)胞的氧化損傷，上述物質(zhì)已被廣泛應(yīng)用為機(jī)體的氧化應(yīng)激標(biāo)記物[20-22]。Jia等[23]研究顯示尼羅羅非魚(yú)(Oreochromisniloticus)腹腔注射H2O2后可導(dǎo)致血清和肝臟組織中MDA含量增加，CAT、SOD和GPx水平降低。本研究結(jié)果也發(fā)現(xiàn)，H2O2作用于鯉魚(yú)后，血清和肝臟中MDA含量均高于對(duì)照組，表明H2O2暴露可使鯉魚(yú)體內(nèi)自由基堆積，導(dǎo)致脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物MDA含量增加。同時(shí)血清和肝臟中SOD、CAT和GPx活性均明顯下降，說(shuō)明機(jī)體內(nèi)H2O2和羥基自由基生成過(guò)量，SOD、CAT和GPx被大量消耗，使機(jī)體抗氧化能力下降。這與其他研究結(jié)果基本一致[24-25]。

圖6 AAEO對(duì)H2O2暴露鯉魚(yú)肝相關(guān)抗氧化基因的影響Fig.6 Effects of AAEO on liver related antioxidant genes of carp exposed to H2O2

ALT和AST主要分布在肝細(xì)胞內(nèi)，當(dāng)肝損傷時(shí)兩者活性會(huì)升高；TP和ALB含量是肝臟合成功能的關(guān)鍵指標(biāo)，當(dāng)肝功能受到損害時(shí)，兩者含量會(huì)明顯下降[26-27]。本研究中，H2O2作用于鯉魚(yú)后，導(dǎo)致ALT和AST活性升高，而TP和ALB含量下降，肝臟組織切片出現(xiàn)明顯病理變化，表明H2O2的氧化應(yīng)激引起了鯉魚(yú)肝臟的損傷。

已有研究表明，多種物質(zhì)的抗氧化能力在肝保護(hù)中發(fā)揮著主要作用，如馬朝陽(yáng)等[28]研究發(fā)現(xiàn)樺木酸可以減緩環(huán)磷酰胺對(duì)小鼠肝臟的脂質(zhì)過(guò)氧化而預(yù)防肝臟的損傷；劉丹等[29]研究發(fā)現(xiàn)地鱉肽可通過(guò)提高肝抗氧化酶活性抑制脂質(zhì)過(guò)氧化，從而改善四氯化碳對(duì)小鼠的肝損傷；肖鳳琴等[30]研究表明酸棗仁黃酮可以通過(guò)提高抗氧化作用而減輕全氟辛烷磺酸對(duì)小鼠肝臟的損傷。本研究也發(fā)現(xiàn)，AAEO可以降低MDA含量，提高SOD、CAT和GPx活性，同時(shí)有效降低血清中ALT和AST活性，增加TP和ALB含量，且組織切片觀察也發(fā)現(xiàn)AAEO組中肝臟組織的病理變化得到緩解。這表明AAEO可以通過(guò)誘導(dǎo)鯉魚(yú)肝組織中抗氧化能力的升高和脂質(zhì)過(guò)氧化的降低，來(lái)消除過(guò)多的自由基抑制氧化應(yīng)激，從而減輕肝臟的氧化損傷。

Nrf2是機(jī)體抗氧化防御系統(tǒng)的關(guān)鍵調(diào)控因子，可以調(diào)控下游抗氧化基因的表達(dá)，其高水平表達(dá)于肝臟中[31]。研究發(fā)現(xiàn)氧化應(yīng)激可以促使Nrf2 mRNA表達(dá)量的下調(diào)[32-33]。本試驗(yàn)中H2O2作用于鯉魚(yú)后Nrf2 mRNA表達(dá)量顯著下調(diào)，而AAEO可以誘導(dǎo)Nrf2 mRNA表達(dá)量的升高，上調(diào)Mn-SOD、Cu/Zn-SOD、CAT和GPxmRNA的表達(dá)量。這可能是由于Nrf2被AAEO激活后進(jìn)入到細(xì)胞核中，與抗氧化反應(yīng)元件結(jié)合后誘導(dǎo)了下游抗氧化酶SOD、CAT和GPx基因的表達(dá)，從而提高了機(jī)體抗氧化系統(tǒng)清除自由基的能力。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)用H2O2誘導(dǎo)構(gòu)建鯉魚(yú)肝臟氧化損傷模型，研究AAEO對(duì)鯉魚(yú)肝臟氧化損傷的保護(hù)作用。結(jié)果表明，AAEO能夠緩解H2O2誘導(dǎo)的鯉魚(yú)肝臟中ALT、AST活性上升和TP、ALB含量下降，血清和肝臟組織中SOD、CAT、GPx活性下降，MDA含量上升以及肝臟組織病理?yè)p傷和抗氧化基因的表達(dá)降低，在一定程度上對(duì)其肝臟起到了保護(hù)作用。