槲皮素對急性腦出血大鼠神經功能恢復的作用及對PKC/ERK信號通路的影響

李建波，耿煒，周濤，張鈞，朱立艷，李曉蕾，張倩，劉吉祥，李曉鵬

急性腦出血是一種常見急危重癥，屬于非外傷性的腦實質出血，具有較高致殘率、病死率[1]。急性腦出血主要病理過程為腦實質內血液快速蓄積，致顱內壓增高、腦組織損傷，病死患者多出現在發病后兩天內，50%～70%存活者可遺留不同程度神經功能損傷[2]。因此，探尋急性腦出血有效治療方法，以控制病情，減輕神經功能損傷，改善預后，具有重要意義。傳統醫學認為，血瘀貫穿急性腦出血發生發展始終，且為腦出血后各種病理生理變化重要機制之一，需自活血化瘀方向加強辯證施治[3]。槲皮素是一種天然黃酮類化合物，廣泛分布于自然界各類植物花、葉中[4]。既往研究顯示，槲皮素可活血化瘀，具有抗氧化、抗炎、改善血液循環等作用，可減輕神經損傷[5]。目前，就槲皮素對急性腦出血神經功能恢復影響及具體作用機制報道仍不多。本研究開展動物實驗，重點分析槲皮素對急性腦出血大鼠神經功能恢復的作用，并探討其作用機制。現報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 50只SPF級SD大鼠(雄性，8周齡)，體質量(300±10)g，購自北京富豪實驗動物養殖中心[許可證號：SCXK(京)2019-0015]。購入后保持環境通風，溫度(22±2)℃，濕度55%～60%，適應性喂養7 d。本實驗符合“3 R”標準，經邯鄲市第一醫院動物倫理委員會批準。

1.1.2 藥物、試劑和儀器 槲皮素(純度≥98%，四川省維克奇生物科技有限公司)，磷酸化蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)激動劑佛波醇酯(上海康成生物工程有限公司)。Ⅶ型膠原酶(美國Sigma公司)，白細胞介素-6(interleukin-6，IL-6)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)酶聯免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)試劑盒(北京東亞生物技術研究所)，原位末端脫氧核苷酸轉移酶標記(terminal deoxynucleoitidy transferase mediated nick end labeling，TUNEL)試劑盒(上海澤葉生物有限公司)，蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin staining，HE)試劑盒(美國Genmed公司)，兔抗大鼠PKC、磷酸化PKC(phosphorylate-PKC，p-PKC)、胞外信號調節蛋白激酶1/2(extracellular-regulated kinase1/2，p-ERK1/2)、磷酸化ERK1/2(phosphorylate-ERK1/2，p-ERK1/2)一抗及山羊抗兔IgG二抗(武漢博士德生物工程有限公司)。DG5031酶聯免疫酶標儀(華東電子醫療公司)，LV150光學顯微鏡(日本Nikon株式會社)，GelDoc凝膠成像系統(美國Bio-Rad公司)。

1.2 方法

1.2.1 建模及分組 隨機取10只大鼠作為A組，剩余大鼠參照文獻方法進行建模[5]，術前禁食12 h，禁水6 h。大鼠腹腔注射2%戊巴比妥鈉(50 mg/kg)進行麻醉，俯臥位固定于立體定位儀。顱骨暴露，穿刺點為前囟后0.2 mm、向左3 mm處。以牙科鉆垂直鉆穿露骨，經鉆孔點緩慢注入2.5 μL Ⅶ型膠原酶，留針5 min，推針，縫合。大鼠麻醉清醒后，采用神經功能缺陷評分(neurological severity scores，NSS)評估神經功能損傷情況[6]：可正常活動，神經功能無異常，計0分；癱瘓側前肢無法充分伸展，計1分；活動時向癱瘓側旋轉，計2分；活動時向癱瘓側傾倒，計3分；不能自發行走，意識喪失，計4分。得分1～3分為建模成功。40只大鼠建模成功34只，成功率為85.0%。34只大鼠隨機分為B組、C組、D組、E組，分別納入8只、8只、9只、9只。A組術中注入與Ⅶ型膠原酶等量的生理鹽水，其余操作同上，作為對照。

1.2.2 給藥方法 建模成功后1 h后，參照文獻用量[7]，E組腹腔注射含75 mg/kg槲皮素的生理鹽水1 mL，D組腹腔注射含75 mg/kg槲皮素+10 μL/kg PKC激動劑佛波醇酯混合液的生理鹽水1 mL，B組腹腔注射含10 μL/kg PKC激動劑佛波醇酯的生理鹽水1 mL，A組、C組以1 mL生理鹽水腹腔注射，1次/d，連續給藥4周。

1.2.3 組織取材 各組治療完成后24 h，以NSS評分評估神經功能損傷，判斷神經功能恢復情況。處死大鼠，各組分別隨機取4只腦組織，分為4份。其中2份置于4%多聚甲醛固定，2份置于液氮保存。各組剩余大鼠中隨機取4只，剝取完整腦組織，放置在干凈濾紙上，去除腦組織表面滲液、血跡，稱重，以此為濕重。隨后將腦組織置于60 ℃烘箱烘烤，共48 h，稱重，以此為干重。以干濕法檢測腦組織濕重/干重(wet/dry weight ratio，W/D)值。

1.2.4 ELISA法檢測IL-6、TNF-α水平 取1份液氮保存的腦組織，生理鹽水沖洗，用組織搗碎機研磨制成10%組織勻漿，10 000 r/min在4 ℃條件下離心15 min，取上清。按照ELISA試劑盒說明書準備樣品、抗體包被、封閉、加樣、加入酶標抗體、顯色，終止反應后觀察酶標儀450 nm處吸光值，繪制標準曲線，計算樣本中IL-6、TNF-α水平。

1.2.5 免疫熒光TUNEL/Neun雙染法檢測神經細胞凋亡檢測 取1份4%多聚甲醛固定腦組織，石蠟包埋，切片，厚度4 μm，脫蠟至水，PBS洗滌，蛋白酶K 37 ℃消化15 min，PBS洗滌，滴加TDT+DIG-UTP混合液孵育2 h，PBS洗滌，加入封閉液37 ℃封閉30 min，加入Neun抗體4 ℃過夜，PBS洗滌，加入熒光二抗37 ℃孵育30 min。熒光顯微鏡下觀察神經元凋亡情況。凋亡率=TUNEL陽性細胞數/Neun陽性細胞數×100%。

1.2.6 HE染色觀察腦組織病理形態學檢測 取1份4%多聚甲醛固定腦組織，常規脫水、透明、包埋、切片(厚度4 μm)、烤片，二甲苯脫蠟、水洗，蘇木精染色5 min，1%鹽酸酒精分化，伊紅染色3 min。再次脫水、透明，中性樹膠封片，光鏡下觀察。

1.2.7 Western blot檢測蛋白相對表達量 取1份液氮保存腦組織，加入RIPA裂解液冰上裂解，10 000 r/min 4 ℃條件下離心10 min，取上清液。BCA法蛋白定量，100 ℃水浴使蛋白變性。SDS-PAGE凝膠電泳，轉至PVDF膜，用含有5%脫脂奶粉的封閉液封閉1 h。加1∶1 000稀釋的PKC、p-PKC、ERK1/2、p-ERK1/2、β-actin一抗，4 ℃孵育過夜，TBST洗膜，加1∶2 500稀釋的二抗，室溫孵育2 h。TBST洗膜。ECL顯影，Image J軟件分析蛋白條帶，計算目的蛋白相對表達水平。

2 結 果

2.1 神經功能 A組NSS評分為0，B組、C組、D組和E組NSS評分分別為(2.78±0.14)分、(2.39±0.12)分、(2.01±0.13)分、(1.46±0.12)分，與B組比較，C組、D組、E組NSS評分降低(P<0.05)；與C組比較，D組、E組NSS評分降低(P<0.05)；與D組比較，E組NSS評分降低(P<0.05)。

2.2 W/D值 A組、B組、C組、D組和E組W/D值分別為(3.21±0.15)、(5.62±0.21)、(4.91±0.21)、(4.64±0.15)、(4.22±0.14)，各組W/D值比較，差異有統計學意義(P<0.05)。與A組比較，B組、C組、D組、E組W/D值升高(P<0.05)；與B組比較，C組、D組、E組W/D值降低(P<0.05)；與C組比較，D組、E組W/D值降低(P<0.05)；與D組比較，E組W/D值降低(P<0.05)。

2.3 IL-6、TNF-α水平 各組IL-6、TNF-α水平比較，差異有統計學意義(P<0.05)。與A組比較，B組、C組、D組、E組IL-6、TNF-α水平升高(P<0.05)；與B組比較，C組、D組、E組IL-6、TNF-α水平降低(P<0.05)；與C組比較，D組、E組IL-6、TNF-α水平降低(P<0.05)；與D組比較，E組IL-6、TNF-α水平降低(P<0.05)。見圖1。

與A組比較，aP<0.05；與B組比較，bP<0.05；與C組比較，cP<0.05；與D組比較，dP<0.05

2.4 神經細胞凋亡 A組、B組、C組、D組、E組細胞凋亡率分別為(8.52±2.21)%、(72.15±2.98)%、(60.65±2.92)%、(35.15±2.78)%、(15.74±2.42)%。各組神經細胞凋亡率比較，差異有統計學意義(P<0.05)。與A組比較，B組、C組、D組、E組神經細胞凋亡率升高(P<0.05)；與B組比較，C組、D組、E組神經細胞凋亡率降低(P<0.05)；與C組比較，D組、E組神經細胞凋亡率降低(P<0.05)；與D組比較，E組神經細胞凋亡率降低(P<0.05)。見圖2。

圖2 各組腦組織神經細胞凋亡(TUNEL/Neun熒光雙染，×400)

2.5 腦組織病理形態學 HE染色顯示，A組腦組織神經細胞數目較多，形態結構清晰，排列規整。B組、C組神經細胞結構紊亂，神經元數目減少，細胞核碎裂，其中B組異常變化更為顯著。與B組、C組比較，D組、E組神經細胞結構、神經元數目、細胞核等形態異常有所改善，其中E組改善更顯著。見圖3。

圖3 各組腦組織病理形態學(HE染色，×400)

2.6 PKC、p-PKC、ERK1/2、p-ERK1/2蛋白相對表達量 各組p-PKC、p-ERK1/2蛋白相對表達量比較，差異有統計學意義(P<0.05)；各組PKC、ERK1/2蛋白相對表達量比較，差異無統計學意義(P>0.05)。與A組比較，B組、C組、D組、E組p-PKC、p-ERK1/2蛋白相對表達量升高(P<0.05)；與B組比較，C組、D組、E組p-PKC、p-ERK1/2蛋白相對表達量降低(P<0.05)；與C組比較，D組、E組p-PKC、p-ERK1/2蛋白相對表達量降低(P<0.05)；與D組比較，E組p-PKC、p-ERK1/2蛋白相對表達量降低(P<0.05)。見圖4、圖5。

圖4 各組蛋白表達免疫印跡檢測

與A組比較，aP<0.05；與B組比較，bP<0.05；與C組比較，cP<0.05；與D組比較，dP<0.05

3 討 論

腦出血是一種常見腦卒中類型，急性期病死率較高，達30%～40%[8]。急性腦出血發病后，腦實質內可出現血腫形成，血腫壓迫引發繼發性神經功能損傷，影響預后[9]。西醫治療急性腦出血多以對癥處理為主，如控制腦水腫、降顱壓、預防腦疝形成等，但部分患者預后仍不理想[10]。近年來，中醫在急性腦出血中的應用表現出獨特優勢，特別是中醫辨證論治原則的實施，為急性腦出血治療提供了新的突破口。中醫認為，急性腦出血屬于“中風”范疇，病因病機包括積損正衰、勞倦內傷、情志不暢、肝郁化火，致腦絡之血破入腦室，淤血阻絡，瘀血貫穿本病發生發展之始終，治療當以活血化瘀為主[11]。槲皮素是一種天然抗氧化劑，可活血化瘀、流通血脈，促進血液循環，且具有抗病毒、抗炎、抗氧化、抗血栓等較多生物活性。目前，臨床就槲皮素對急性腦出血大鼠神經功能恢復影響及具體作用機制尚無明確定論，而就此進行深入分析，利于為急性腦出血早期治療提供新方向。

槲皮素具有多種藥理活性，分子量為302.24，可穿透血腦屏障發揮作用，任思沖等[12]研究顯示，槲皮素可有效透過血腦屏障，抑制人膠質母細胞瘤U251細胞增殖。最新研究表明，加載槲皮素的納米顆粒較游離化合物對血腦屏障的穿透性更強[13]。這些研究為槲皮素應用于腦部疾病的治療奠定了理論基礎。此外，動物實驗表明，槲皮素能減少全腦缺血/再灌注損傷大鼠海馬組織細胞凋亡，減輕腦組織損傷[14]；槲皮素還可減少衰老小鼠腦內炎性因子生成，改善學習記憶功能障礙[15]，均證實槲皮素的腦保護作用。本研究發現，槲皮素應用后大鼠NSS評分及IL-6、TNF-α水平降低，W/D值、神經細胞凋亡下降，腦組織病理形態學異常改變明顯改善，這提示槲皮素在急性腦出血大鼠中的應用具有一定價值，可減輕炎性反應，緩解腦水腫，抑制神經細胞凋亡，促進神經功能恢復。徐蘭娟等[16]也發現，實驗性大鼠腦出血早期治療中應用槲皮素能抑制炎性反應，減少細胞凋亡，促進神經功能恢復，與本研究共同證實槲皮素在改善腦出血神經功能損傷中的作用。

PKC屬于絲/蘇氨酸蛋白激酶，激活后可導致一系列靶蛋白的絲氨酸殘基和(或)蘇氨酸殘基出現磷酸化，給功能蛋白活性造成影響，調控機體代謝、細胞增殖、細胞分化等生理、生化反應[17]。另外，PKC可經由對ERK1/2轉錄活性進行調節，減輕氧化應激反應，減少細胞凋亡[18-19]。Li等報道[20]，ERK1/2活性增強，可激活多種信號傳導機制，調節腦卒中大鼠神經元凋亡。傅思銘等[21]還提出，抑制PKC/ERK信號通路，可減輕腦出血小鼠氧化應激反應，減少神經元凋亡，改善神經功能損傷。這些研究均提示，PKC/ERK信號通路可能在急性腦出血發生發展及病情控制中發揮一定作用。本研究結果顯示，槲皮素治療后大鼠p-PKC、p-ERK1/2蛋白相對表達量降低，且經應用PKC激動劑進一步驗證，這提示槲皮素可抑制PKC/ERK信號通路，推測這可能是槲皮素發揮促進急性腦出血大鼠神經功能恢復的重要作用機制之一。

綜上所述，槲皮素可減輕急性腦出血大鼠炎性反應，抑制神經細胞凋亡，緩解腦組織損傷，促進神經功能恢復，作用機制可能與調節PKC/ERK信號通路有關。本研究不足之處在于僅研究了槲皮素通過PKC/ERK信號通路的作用，未研究其他途徑，今后仍需進一步深入分析。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。