“果凍”藥敏檢測法篩選腎母細胞瘤個體化治療方案的初步研究

張守華，蘇凡優，何遠橋，雷俊，項燈，曾俊權，曾金娣，諶衛龍，李匡凡，閻金龍

（1.江西省兒童醫院普外科, 南昌 330006；2.南昌大學動物科學部, 南昌 330006；3.井岡山大學附屬醫院腫瘤科，吉安 343000；4.南昌大學第二附屬醫院肝膽外科，南昌 330006）

腎母細胞瘤是兒童一種最常見的腎臟腫瘤,其發病率占兒童惡性腫瘤的6%[1]。 手術+化療的治療方案在過去10 年間已經取得了非常顯著的進展,但仍然有10%左右的患者預后較差。 其原因可能與部分患者對其化療方案不敏感或者耐藥有關[1-3]。因此，術后篩選以及對患者進行敏感、有效的個體化治療方案已經成為目前研究的焦點。

由于腫瘤異質性的特點及其自身微環境的差異， 使得不同患者對相同的化療方案的敏感性和效果具有顯著的差異[4]。 因此，如何預測不同的個體腫瘤對化療藥物的敏感性， 有效地篩選并應用抗腫瘤藥，成為目前迫切需要解決的問題。 本文應用“果凍”藥敏檢測法對腎母細胞瘤個體化治療方法進行了初步研究[5]。

1 對象與方法

1.1 腫瘤樣本 腫瘤樣本均來自江西省兒童醫院。經手術切除的腎母細胞瘤標本， 取樣后快速裝入含有組織保存液的50 mL 無菌離心管中， 在2 h內送至實驗室， 樣本運輸裝置內預先放入足夠的冰塊，在整個過程樣本處在低溫環境中。 腫瘤樣本納入標準：通過手術獲取原位腫瘤組織標本，所納入患者術后均需化療。

1.2 材料及試劑 “果凍”藥敏檢測試劑盒（均購自南昌樂悠生物科技有限公司），MTT （均購自美國Sigma 公司），樣本保存液、順鉑（齊魯制藥有限公司），伊立替康（江蘇恒瑞醫藥股份有限公司），二甲基亞砜（DMSO）、環磷酰胺（江蘇盛迪醫藥有限公司），紫杉醇（?？谑兄扑帍S有限公司），長春新堿（鄭州恒峰藥業有限公司），依托泊苷（江蘇恒瑞醫藥股份有限公司），阿霉素（輝瑞制藥（無錫）有限公司），奧沙利鉑（江蘇恒瑞醫藥股份有限公司）。

1.3 腫瘤樣本處理 首先剔除壞死及無活性的組織，在生物安全柜內使用0.4% 的錐蟲藍染液檢測腫瘤組織的活性，隨后放入含量為0.2% 的碘伏溶液中浸泡，時間約30 s，然后用3% 雙抗的磷酸鹽緩沖液（PBS）反復沖洗組織，并沖洗殘留碘伏，最后將腫瘤組織分割成大約2 mm × 2 mm × 2 mm的組織塊。

1.4 組織塊接種 將“果凍”藥敏檢測試劑盒取出置于冰上，使其處于低溫狀態，每個孔內加入上述分割后的微組織塊，加入含水凝膠的混合液，使其完全淹沒微組織塊，然后放入二氧化碳的細胞培養箱中孵育約2～3 h，待水凝膠完全凝固后，每孔加入100 μL 培養基，再次放入細胞培養箱中繼續培養。

1.5 藥物處理 在細胞培養箱中培養24 h 后，將96 孔板中的原培養基棄去， 對照組加入不含藥物的完全培養基，藥物組加入含有測試抗腫瘤藥物的完全培養基；兩組均每24 h 更換一次培養液。藥物組和對照組所用的細胞培養基的成分完全相同。

1.6 敏感性檢測 上述藥物組在含有抗腫瘤藥物的培養基中培養3～7 d 后， 棄去培養基， 用無菌PBS 洗滌3 次，再向孔中加入MTT 溶液，6 h 后將MTT 溶液棄去，將微組織塊從水凝膠中取出，再放入新的細胞培養孔中， 然后加入200 μL 二甲基亞砜后震蕩10 min， 從上述培養板中的每個孔中吸取100 μL 溶液加入新的96 孔細胞培養板的板孔中，使用酶標儀檢測每孔的吸光度（OD）值。

1.7 結果分析 用酶標儀檢測 在490 nm 波長處的OD 值。 各組藥物抑制率=（1-藥物組OD 值/對照組A 值）×100%， 其中根據MTT 比色法檢測藥物敏感性的判斷標準為抑制率的30%， 抑制率小于30% 的藥物可視為無效抗腫瘤藥物。 實驗重復3 次，取平均值。

2 結果

2.1 患者一般資料 本次共納入四位患者， 其中1男3 女，平均年齡2.23 歲，均行腫瘤切除術，術前未化療，術后病理診斷均為腎母細胞瘤，患者均需要接受化療。

2.2 MTT 比色法結果及藥物抑制率 微組織腫瘤塊加入MTT 液6 h 后加入DMSO 呈現顯色反應，組織活性越差其顯色約淺， 反之腫瘤組織活性越好顏色越深（圖1）。 經MTT 液顯色后通過計算不同給藥組的藥物抑制率，臨界值為30%，高于30%判定為有效，低于30%判定為無效。 四位患者腫瘤抑制率如下表1 所示。

表1 患者腫瘤抑制率

圖1 MTT 比色法結果顯示藥物抑制率

3 討論

相關研究證實腫瘤的異質性及不同腫瘤微環境的個體差異是影響腫瘤化療敏感性的關鍵因素， 也是導致不同個體間對相同化療方案的化療效果存在差異的重要因素[6-7]。 盡管在大多數腫瘤治療中存在不同的化療方案， 但臨床醫師往往難以在多種化療方案中選擇患者敏感的方案， 從而導致治療效果不確切，無法對患者進行精準治療。目前常用的藥物敏感性檢測模型主要為永生化的細胞系模型及細胞系構建的腫瘤動物模型， 二者皆與患者腫瘤具體差異較大， 后者雖然能客觀地反映患者腫瘤的異質性，但其耗時長且花費高。 本實驗直接采用患者的腎母細胞瘤組織， 有效地克服了藥物篩選中腫瘤的異質性與腫瘤微環境不一致的情況。 在傳統細胞培養技術的基礎上創新性地加入了水凝膠成分， 利用水凝膠提供的三維立體空間環境更好地保護了腎母細胞腫瘤微組織塊的活性， 并保留了腫瘤的微環境， 此法被稱之為“果凍”藥敏檢測法[8]。 通過“果凍”法進行化療藥物敏感性的篩選， 其結果更能準確地反映臨床患者對不同化療藥物的反應。 值得注意的是，從腫瘤獲取到藥物敏感性檢測結束的整個過程，操作簡單、耗時較短，費用相對更低。

目前臨床上腎母細胞瘤的化療藥物主要包括鉑類、阿霉素、依托泊苷、環磷酰胺、長春新堿、伊立替康等[9-10]。 本研究中所用的藥物方案主要是依據臨床常用方案進行的選擇。 雖然近年來腎母細胞瘤的化療效果已經取得了顯著進展， 但仍然有部分患者對化療藥物不敏感[1-3]。 在本研究中4 例患者在使用紫杉醇后的腫瘤抑制率分別為55%、48%、62%和84%， 表明紫杉醇具有顯著的腫瘤抑制效果； 這可能是因為紫杉醇作為細胞周期抑制劑，能夠同時抑制體內、外的腫瘤細胞[11]。順鉑的腫瘤抑制率也比較高， 其抑制率分別為36%、41%、24%及34%，但是順鉑很容易出現耐藥性。 盡管在本次實驗中患者對紫杉醇和順鉑敏感，但在用藥選擇上仍以臨床方案為主，如出現耐藥等情況，再考慮根據實驗結果選擇包含相應敏感藥物的方案。 然而四例患者對環磷酰胺均未表現出敏感性， 這可能是由于環磷酰胺需要先在肝臟經酶轉化成4-羥基環磷酰胺，再經過進一步的轉化發揮抗腫瘤作用，單獨在體外沒有抗腫瘤活性[12]。也不排除是藥物自身代謝途徑的影響。 值得注意的是，四例患者對腎母細胞瘤最常用的藥物長春新堿也未能表現出良好的反應。

本研究通過四例樣本的篩選結果， 發現 “果凍”藥敏檢測法具有經濟、快速且藥敏結果與臨床化療方案療效一致性較高的優勢，但是“果凍”藥敏檢測法也具有如下不足之處：首先，本研究的樣本量相對較少，尚缺乏足夠的數據支撐研究結論；其次，作為一種體外的腫瘤藥物篩選法，“果凍”藥敏檢測法對于需要進行體內代謝才能發揮腫瘤作用的藥物如環磷酰胺評估欠佳。 最后，尚未將此藥篩結果用于臨床患者治療， 其臨床應用效果有待于進一步評估。 而且4 例腎母細胞瘤患者依據上述方法進行標準化療方案的藥物敏感性檢測，其結果表現出極大的個體化和差異性。 本身即說明了化療方案因“瘤”而異的必要性。 總之，這表明“果凍”藥敏檢測法用于腫瘤化療藥物篩選具有可行性依據，同時該方法簡單、快速，用于腎母細胞瘤術后化療藥物的初步篩選具有很大的優勢，在腎母細胞瘤個體化的治療方案應用中具有潛在的應用價值。