探討miRNA 標記物在骨髓間充質干細胞對成骨誘導分化過程中的調控機制

黃志剛，馬克，劉晶

深圳市第三人民醫院骨科，廣東深圳 518100

當前，臨床治療中移植的成骨細胞主要源自自體成骨細胞及骨髓間充質干細胞誘導分化而得到的細胞[1]。骨髓間充質干細胞的優點是自我更新能力強且便于取材，應用前景更為廣闊。目前，臨床對于骨髓間充質干細胞對成骨細胞誘導分化的機制尚無統一定論，并且誘導分化出來的細胞大都是成骨樣細胞[2]。miRNA 屬于具備一定調控作用的微小分子，其調控腫瘤發生發展的作用已經得到證實[3]。有研究指出，miRNA 可調節骨及成骨細胞分化，但得到miRNA 靶基因的確切數據很少，尚無法明確miRNA 在成骨細胞誘導分化中發揮的具體調控機制[4]。該次研究選取2016年6月—2018年1月該院收治的40例脊柱結核患者為研究對象，通過基因芯片技術對骨髓間充質干細胞誘導分化成骨細胞過程中miRNA 差異表達進行觀察，并篩選出特異性miRNA，以明確其確切的調控機制，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取該院收治的40例脊柱結核患者進行該次研究。納入標準：生長發育正常；年齡≥18歲；經臨床表現、實驗室檢查及影像學檢查確診；均接受手術治療；脊柱結核活動期同時具備嚴重骨質破壞、較大寒性膿腫；行徹底病灶清除術；組織病理學檢查結果發現干酪樣物質或朗罕斯細胞和/或結核桿菌組織標本培養陽性；無其他可疑疾病；患者知曉該次研究內容并簽訂知情同意書。排除標準：早期影像學表現不明顯者；合并其他（脊柱外）臟器結核病者；骨病治愈型、靜止型脊柱結核者；行器官移植、同種異體組織移植及人工假體植入者；合并HIV 等自身免疫性疾病者。該研究經醫院倫理委員會審核批準。

1.2 方法

1.2.1 試劑與儀器TGF-β1、異硫氰酸熒光素、CD54-FITC、CD45-FITC、CD90-FITC、兔抗大鼠神經巢蛋單抗、兔抗大鼠神經元特異性烯醇化酶單抗、PCR 引物、倒置相差顯微鏡、BIGeneAmp9700PCR 儀、FC500MCL/MPL流式細胞儀。

1.2.2 骨髓間充質干細胞分離與培養抽取受試者股骨骨髓，通過磷酸鹽緩沖液在肝素抗凝管中進行稀釋，將人淋巴細胞分離液加入提取液中，離心（1 400 g）10 min 后取中間層，應用PBS 進行兩次沖洗，繼而接種到培養瓶中。在37℃、4%CO2、94%培養濕度的條件下進行培養，培養密度維持在1×109/L，培養3 d 后換液，之后每間隔2 d 換液1 次。換液后對細胞生長情況進行顯微觀察，細胞單層達到80%融合度后實施胰蛋白酶消化，并以1:2 的比例進行傳代培養，培養代數分別記為P1、P2、P3、P4。

1.2.3 骨髓間充質干細胞鑒定應用PBS 對P4代骨髓間充質干細胞洗滌3次，細胞濃度維持在1×106個/L，將其制成1 mL 細胞懸液并放置在EP 管中，繼而分別加入5 μl 異硫氰酸熒光素、CD54-FITC、CD45-FITC、CD90-FITC 單抗，同時設定同型陰性對照，在37℃條件下反應半小時，離心（800 g）20 min，應用PBS對細胞重懸，通過流式細胞儀實施檢測。

1.2.4 骨髓間充質干細胞成骨誘導培養及鑒定以5×106個/L的濃度P4代骨髓間充質干細胞1 mL，將基礎培養液加入后按其組成把細胞分為對照組和陽性組，兩組細胞進行3 d 的培養后進行培養液更換，之后每間隔2 d 進行一次更換，培養3 周。結束誘導后去除培養液，應用PBS 沖洗3 次，應用4%多聚甲醛進行20 min固定，繼而石蠟包埋并常規切片，甲苯胺藍染色。

1.2.5 基因芯片檢查收集成骨細胞誘導前（T0）及培養后1 周（T1）、2 周（T2）、3 周（T3）的骨髓間充質干細胞，應用一步法進行總RNA 提取，熒光標記擴增完成后的RNA 樣品，實施激光掃描，通過SAM version 2.1 軟件對成骨細胞誘導后有差異表達的miRNA進行分析。

1.2.6 miRNA 驗證 把成骨細胞誘導培養3 周的總RNA 反轉錄為cDNA，以實時定量miRNA 為引物、cDNA 為模板實施PCR 反應，設置反應條件如下：保持引物濃度在0.3 μmmol/L左右，96℃條件變性20 s，然后60℃條件退火45 s，共進行35個循環。

1.3 統計方法

采用SPSS 21.0 統計學軟件處理數據，符合正態分布的計量資料用（±s）表示，采用t檢驗；一致性采用Kappa檢驗，≤0.4Kappa值≥0.75 表示一致性極好，Kappa值＜0.75 表示一致性較高，Kappa值＜0.4 表示一致性較差，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

骨髓間充質干細胞向成骨細胞分化期間篩選出差異表達miRNA，其中，miR-130b、miR-193b 為表達 上 調miRNA，miR-135、miR-424 為 表 達 下 調miRNA。于原樣本中實施實時熒光定量PCR 驗證，驗證結果同基因芯片篩選結果存在高度一致性（Kappa=0.913，P＜0.05）。見表1。

表1 實時熒光定量PCR檢測miRNA表達(±s)

表1 實時熒光定量PCR檢測miRNA表達(±s)

注：△表示與T0相比，P＜0.05

miRNA miR-130b miR-193b miR-424 miR-135 T0 1.00±0.06 1.00±0.12 1.00±0.15 1.00±0.15 T1（1.71±0.15）△（1.07±0.14）△（0.95±0.05）△（0.66±0.04）△T2（1.83±0.21）△（1.48±0.16）△（0.87±0.03）△（0.62±0.04）△T3（2.75±0.23）△（1.93±0.22）△（0.68±0.02）△（0.55±0.04）△

3 討論

在全身骨及關節結核病中，脊柱結核的患病率位居首位，且最為常見的患病部位為胸腰椎段，脊柱結核在各年齡段人群中均有發病的可能，而高發人群是青壯年，由于脊柱結核病存在破壞性生長情況，對患者身體正常發育的影響極為嚴重[5]。現階段，臨床治療脊柱結核的方案主要有充足睡眠、臥床休息、營養支持等支持療法、抗結核藥物治療、手術治療以及康復治療[6-8]。因脊柱結核導致的椎體破壞單純應用藥物治療是無法完全修復的，而患者行結核病灶清除術治療后會出現結核性骨缺損，需進行植骨填補，否則會導致椎體塌陷，但人工骨移植又會產生諸多并發癥，對此組織工程學修復成為了治療脊柱結核的潛在方案之一[9-11]。miRNA 是一種參與轉錄后進行調控的微小RNA，廣泛存在于生物體中，miRNA 與靶基因miRNA 堿基進行配對，進而致使靶基因miRNA 堿基降解或翻譯受阻，最終發揮出真正的調控作用[12-14]。骨髓間充質干細胞具有自我更新及多向分化的潛在能力，有研究已經證實，骨髓間充質干細胞可分化為成骨細胞、軟骨細胞及脂肪細胞等諸多細胞株，也是主要的成骨進行自我修復的種子細胞來源[15]。

該次研究結果顯示，骨髓間充質干細胞向成骨細胞分化期間篩選出差異表達miRNA9，其中，miR-130b、miR-193b 為表達上調miRNA，miR-135、miR-424 為表達下調miRNA。于原樣本中實施實時熒光定量PCR 驗證，驗證結果同基因芯片篩選結果存在高度一致性（Kappa=0.913，P＜0.05）。這與劉軍政等[16]學者的結論一致，在其研究中得出，給予實時熒光定量PCR 驗證同基因芯片篩選結果存在一致性（Kappa=0.876，P＜0.05）。骨髓間充質干細胞屬于一類具備自我更新能力和多向分化的干細胞，當前多項研究也已經證實了miRNA 會參與到骨髓間充質干細胞多向分化的調節中，但miRNA 具體的調節作用屬于一種非常復雜的調節網絡，目前的研究還處在初級階段[9-10]。

綜上所述，高表達的miR-130b、miR-193b 及低表達的miR-135、miR-424 均能有可能調控骨髓間充質干細胞對成骨細胞的誘導分化過程。但由于骨髓間充質干細胞的誘導方式及來源有所差異，致使既往各研究結果所報道的miRNA 種類存在一定差異，因此，確切地參與調控骨髓間充質干細胞向成骨分化的miRNA尚需深入研究證實。