MAPK13調控膽管癌細胞增殖、侵襲和上皮間質轉化進程的機制研究

王俊，李建剛，李亮

（新疆醫科大學第二附屬醫院 普外科，新疆 烏魯木齊 830028）

膽管癌是一種膽管上皮細胞來源的惡性腫瘤，具有惡性程度高、侵襲性強的特點。近年來膽管癌病死率呈現逐漸上升的趨勢[1-3]。目前研究顯示手術切除可提高膽管癌患者的生存率，手術后5 年生存率約為20%～40%[4-5]；但另一方面，較高的復發率及早期淋巴結轉移仍制約著膽管癌的治療。目前針對膽管癌的研究，不僅需要考慮癌細胞與腫瘤微環境復雜的調控關系，還需要積極尋找到可靠的效應分子以提高膽管癌早期篩查的生物標志物的敏感性和特異性[6-7]。

絲裂原活化蛋白激酶（mitogen activated protein kinase，MAPK）在信號轉導中具有重要作用，哺乳動物細胞中有四個主要的MAPK家族：ERK1/2、ERK5、JNK和p38 MAPK，其中p38 MAPK又由四個成員組成：p38α（MAPK14）、p38β（MAPK11）、p38γ（MAPK12）和p38δ（MAPK13）[8-9]。有研究表明，MAPK13能夠影響膽管癌細胞的遷移和侵襲，這表明其在膽管癌中可能扮演重要角色[10-11]。我們前期預實驗發現，MAPK13在膽管癌患者組織中表達升高，因此本研究試圖擴大樣本量進一步分析其在膽管癌組織和細胞中的表達情況，探討MAPK13對細胞遷移和侵襲及上皮間質轉化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）過程的影響，以期為未來靶向治療和早期生物標志物的選擇提供理論依據。

1 材料和方法

1.1 臨床組織標本

收集2018年1月至2019年12月新疆醫科大學第二附屬醫院18例膽管癌患者的組織標本。所有標本均經病理檢查證實為膽管癌?；颊吣挲g44～77 歲；其中男10例，女8例。樣本TNM分期：Ⅰ期2例，Ⅱ期6 例，Ⅲ期8 例，Ⅳ期2 例。所有膽管癌患者術前均未接受過放化療或其他方式膽管癌治療。手術切除的所有膽管癌組織及鄰近組織標本立即液氮保存，-80 ℃冰箱長期保存。研究獲我院倫理委員會批準（批準號：20171220）。

1.2 細胞培養

膽管癌細胞系RBE、LICCF、CCLP1、QBC939和人膽管上皮細胞HIBEC均購自北納生物（北京）。RBE細胞用碳酸氫鈉（1.5 g/L）、葡萄糖（2.5 g/L）、丙酮酸鈉（0.11 g/L）在含10%胎牛血清的RPMI-1640培養基中培養。HIBEC和QBC939 細胞用90% RPMI-1640和10% FBS培養。LICCF細胞在MEM-EBSS培養基中培養。CCLP1 細胞在含10%胎牛血清的DMEM高糖培養基中培養。所有細胞系均在37 ℃、5% CO2條件下培養。

1.3 微陣列分析篩選腫瘤組織差異表達mRNA

研究選取9 對膽管癌（包含6 例肝內膽管細胞癌，2 例遠端膽管癌和1 例肝門部膽管癌）及其鄰近組織，提取細胞總RNA，以T7 Oligo（dT）為引物，合成cDNA。以cDNA為模型，選擇T7 Enzyme Mix合成cRNA，加入100 μmol/L生物素，通過磁珠純化去除cRNA中的鹽分和酶。通過添加來自Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0 Array的組織形成雜交。cRNA片段化（100 bp）后，在45 ℃預雜交組織中進行雜交。用等量的雜交液代替預雜交液，用生物素標記在cRNA上，使其再次雜交，45 ℃、16 h。洗脫和染色處理后，通過安捷倫微陣列掃描儀獲得數據。使用基因芯片操作軟件1.0版進行分析，用R來構建火山圖和Pheatmaps。標準為log2（差異倍數）＞2，-log10（校正P值）＞2，用于篩選差異表達的mRNA。

1.4 免疫組化分析

組織切片用二甲苯脫蠟，并用各種濃度的乙醇脫水。山羊血清在室溫下孵育15 min后切片加入1滴1∶100稀釋的一抗（MAPK13 Antibody，1∶200，BA2847，武漢博士德），4 ℃冰箱孵育過夜。加入辣根酶標二抗（Rabbit anti-Avidin-HRP，1∶3 000，BA1082，武漢博士德），4 ℃冰箱保存30～40 min。用1滴新鮮制備的DAB溶液顯色20 min。細胞核用蘇木精復染30 s，逐步增加乙醇濃度脫水，并用二甲苯透明、中性樹脂封固進行顯微鏡觀察。

1.5 實時熒光定量PCR（qRT-PCR）分析

通過TRIzol試劑（Invitrogen Life Technologies，美國）從各組細胞中提取總RNA。經NanoDrop 2000（Thermo Fisher Scientific Inc，美國）定量后，用200 ng總RNA，按照說明書使用ReverTra Ace QRT-PCR Kit（日本）進行逆轉錄操作。將結果處理至THUNDERBIRD SYBR? qPCR Mix（日本），進行qRT-PCR分析。根據各參照組中GAPDH的含量，每組重復進行3次。mRNA采用相對定量法計算。引物序列信息見表1。

表1 qRT-PCR引物序列

1.6 蛋白印跡分析

取各處理組100 μg用SDS-PAGE電泳，轉移至PVDF膜，200 mA恒流120 min。室溫下將膜浸入含5%脫脂奶粉的TBST中1 h；加入一抗工作液（抗MAPK13，1∶1 000；抗E-cadherin，1∶500；抗N-cadherin，1∶1 000；抗波形蛋白，1 μg/mL；抗GAPDH，1∶10 000，Abcam，美國），4 ℃過夜。組織用TBST洗滌3次，加入二抗（ab7090，1∶2 000，Abcam，美國），室溫孵育1.5 h。用ECL Plus（Life Technology，上海）對膜進行著色。GAPDH蛋白條帶作為內參。

1.7 細胞轉染

采用雙酶切法克隆人MAPK13轉錄本1ORF克隆載體，PCR法克隆5’端EcoRI限制性內切酶位點和3’端含有BamH1序列的MAPK13片段。采用BamH1雙酶切法獲得載體序列，將PCR產物與消化產物連接。之后提取大量質粒pcDNA3.1-MAPK13，并將提取物保存在-20 ℃。由吉馬公司設計MAPK13 siRNA序列并合成siRNA。si-MAPK13、pcDNA3.1-MAPK13質粒載體和pcDNA3.1 質粒載體均購自吉馬公司。根據說明書用Lipofectamine 2000（Life Technologies，美國）進行轉染，并在37 ℃、5% CO2中孵育48 h。本研究設置如下分組：轉染si-MAPK13組（si-MAPK13組），轉染pcDNA3.1-MAPK13組（MAPK13組），僅轉染pcDNA3.1質粒載體（NC組），未對膽管癌細胞進行任何處理組（Blank組）。

1.8 細胞增殖能力分析

采用CCK-8 試劑盒（上海生物科技有限公司），按照說明書進行操作。實驗重復3次。

1.9 Transwell細胞遷移和侵襲實驗

遷移：用胰蛋白酶消化細胞，PBS洗滌2次并重懸于1%胎牛血清培養基中。將細胞密度調整為5×105/mL，在Transwell室中加入100 μL細胞懸液。常規培養24 h后，取出Transwell小室，PBS洗2次，甲醇固定30 min，適當風干腔室。0.1%結晶紫染色腔室20 min，用濕棉簽擦拭非遷移的上層細胞，PBS洗滌小室3次，顯微鏡下觀察細胞并拍照。

侵襲：用無血清培養基稀釋基質膠，在每個腔室中加入50 μL基質膠，培養箱中培養直至基質膠凝固。2 h后加入200 μL無血清培養基水化Matrigel，保存于培養箱中。經胰蛋白酶消化獲得細胞懸液。上室加入200 μL細胞懸液（含5×103個細胞），下室加入500 μL含10% FBS的細胞懸液。培養24 h后取出細胞，用PBS洗滌2次，4%多聚甲醛固定20 min，0.1%結晶紫染色30 min。用PBS清洗小室2次，并在顯微鏡下拍照。

1.10 裸鼠成瘤實驗

20只BALB/c裸鼠，4～6周齡，購自北京維通利華公司。動物隨機分為4組（每組5只）。按照1.7實驗分組分別接種0.2 mL（約1×107個細胞）到小鼠右側腋窩。觀察小鼠生命和腫瘤生長情況。4周后所有小鼠均存活并通過頸椎脫位處死。測量腫瘤大小、重量。

1.11 統計學分析

使用Graph Pad Prism 6.0軟件進行統計學分析。研究中符合正態分布的數據采用（±s）表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單向方差分析或雙向方差分析，事后兩兩比較采用Tukey檢驗。P＜0.05表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 MAPK13在膽管癌組織中的表達情況

微陣列mRNA差異表達分析顯示，MAPK13 在膽管癌中顯著高表達（圖1A、1B，P＜0.05）。免疫組化分析顯示，MAPK13蛋白在膽管癌組織中的表達量（4.30±0.81）明顯高于癌旁組織（1.09±0.10）（圖1C，t=6.90，P＜0.01）。qRT-PCR檢測顯示，MAPK13在膽管癌組織中的mRNA表達量（3.30±0.10）明顯高于癌旁組織（1.02±0.11）（圖1D，t=27.92，P＜0.01）。進一步的蛋白印跡檢測顯示，MAPK13在膽管癌組織中的蛋白表達水平也明顯高于癌旁組織（圖1E、1F）。以上結果均表明MAPK13在膽管癌組織中高表達。

圖1 MAPK13在膽管癌組織和癌旁組織中的表達情況

2.2 MAPK13對膽管癌細胞增殖和凋亡的影響

為了了解MAPK13在膽管癌細胞生長中的作用，研究首先分析MAPK13在膽管癌細胞中的表達情況。MAPK13 mRNA在膽管癌細胞系RBE（3.41±0.49）、LICCF（2.76±0.30）、CCLP1（1.85±0.20）、QBC939（2.10±0.30）以及正常膽管細胞系HIBEC（1.00±0.01）中均有表達，其中以RBE細胞系中的表達最為顯著（圖2A1，F=26.51，P＜0.01）。因此，本研究選擇RBE細胞系進一步觀察MAPK13在膽管癌中的作用。

圖2 MAPK13對腫瘤細胞增殖及凋亡的影響

轉染MAPK13 siRNA構建基因干擾模型，轉染pcDNA3.1-MAPK13 構建MAPK13 過表達模型，通過qRT-PCR和蛋白印跡分別驗證MAPK mRNA（圖2B1，F=105.5，P＜0.05）和蛋白表達水平，模型構建成功。

利用CCK-8 實驗觀察細胞的增殖情況，si-MAPK13 轉染組OD值明顯低于NC組，轉染外源pcDNA3.1-MAPK13基因后，MAPK13轉染組OD值明顯高于空白對照組（圖2C，F=32.13，P＜0.01）。細胞凋亡結果顯示，當MAPK13 被抑制時，細胞凋亡率增加（16.80±3.13），反之亦然（圖2D，F=34.05，P＜0.01）。以上結果均表明MAPK13的過表達會促進膽管癌細胞增殖并抑制細胞凋亡。

2.3 MAPK13 對細胞遷移和侵襲及上皮間質轉化（EMT）進程的影響

研究結果顯示，MAPK13 被抑制后，細胞遷移（97.34±8.12）和侵襲（41.50±3.00）的數量顯著減少；而當MAPK13過表達，細胞遷移（284.50±25.24）和侵襲（145.45±15.24）的數量顯著增加（遷移見圖3A、侵襲見圖3B，F值分別為52.88和38.14，均P＜0.05）。

圖3 MAPK13對細胞遷移和侵襲及上皮間質轉化（EMT）進程的影響

敲除MAPK13 后，膽管癌細胞中對MAPK13起抑制作用的E鈣黏蛋白（E-cadherin）表達更高（2.23±0.12），而N鈣黏蛋白（N-cadherin）（0.48±0.04）和波形蛋白（Vimentin）（0.62±0.05）表達更低（F值分別為77.00、78.73、25.9；均P＜0.01）；而當MAPK13 過表達時，細胞中E-cadherin、N-cadherin和Vimentin的表達情況與前述相反，這表明MAPK13促進了EMT進程（圖3C，P＜0.05）。

2.4 MAPK13在體內成瘤中的作用

體內成瘤實驗顯示，抑制MAPK13的表達后腫瘤體積和腫瘤重量明顯低于Blank組和NC組；而當MAPK13 過表達時腫瘤體積和腫瘤重量均較NC組增加（圖4A、4B，F值分別為8.99、73.81；均P＜0.01）。進一步的組織病理和Ki-67 免疫組化分析驗證了這一過程（圖4C、4D）。

圖4 MAPK13在裸鼠體內成瘤的作用

通過檢測MAPK13 在腫瘤中 mRNA 和蛋白質的表達驗證了si-MAPK13 和MAPK13 處理組對MAPK13 表達的調控作用（圖4E，P＜0.01）。通過檢測EMT相關蛋白發現，抑制MAPK13表達后，Ecadherin的表達增加，但N-cadherin和Vimentin的表達減少，這表明MAPK13 低表達抑制了EMT進程；而MAPK13的過表達會導致E-cadherin的表達降低，N-cadherin和Vimentin的表達增加，表明過表達MAPK13能夠促進EMT進程（圖4F，P＜0.05）。

3 討論

膽管癌是消化道惡性程度很高的腫瘤之一，盡管臨床多種治療手段，如手術、放化療的應用在一定程度上改善了患者預后，但出現轉移的患者預后仍不佳，因此探索膽囊癌轉移的機制迫在眉睫[12-13]。MAPK13 信號通路在調控腫瘤細胞周期及凋亡相中發揮重要作用[14-15]。有研究顯示MAPK13基因敲除能夠抑制結腸炎誘發的結腸癌[16]，另有研究顯示在黑色素瘤細胞中MAPK13 的過表達能夠抑制腫瘤細胞增殖[17]。這些結果表明MAPK13在腫瘤發生發展中起著重要作用，但MAPK13與膽囊癌的關系尚不清楚。本次研究通過微陣列等一系列實驗發現MAPK13在膽囊癌組織、正常膽囊組織中差異表達，提示MAPK13可能與膽囊癌有關。隨后的體內體外實驗均表明MAPK13過表達能夠顯著促進膽囊癌的惡性行為。這些結果提示，MAPK13參與了膽囊癌的發生發展[18]。

上皮間質轉化（EMT）指上皮細胞發生形態轉變，變為間質細胞的一個過程，是惡性腫瘤侵襲和轉移的關鍵環節[19]。腫瘤在侵襲、轉移過程中伴隨著EMT的發生，因此抑制腫瘤EMT可能是一種治療方法。多種基因或非編碼RNA可通過調控膽囊癌EMT發揮作用，如SIRT3 可抑制膽囊癌細胞EMT，從而發揮其抑制功能[20]；另外miR-182 可靶向促進EMT進而促進膽囊癌侵襲、轉移[21]。EMT在膽囊癌發生、進展中至關重要，那么MAPK13是否也與EMT發生有關？基于此，本研究進行了探索：體內、體外結果均發現，MAPK13過表達激活了腫瘤細胞EMT過程；反之，MAPK13 低表達抑制了腫瘤細胞EMT過程；這提示MAPK13 可能是通過調控腫瘤EMT過程發揮其生物學功能。

但本次研究存在一定的局限性，雖然我們檢測了腫瘤組織中MAPK13的表達，但其與膽囊癌臨床病理特征、預后的關系尚需要進一步分析；另外，對于MAPK13調控膽囊癌細胞的具體機制以及下游通路有待進一步研究探索。