嗜堿纖維素分解細菌的篩選?鑒定及酶活分析

張越鋒 呂玲玲 張海沈 王開權

摘要 [目的]從新疆某棉漿廢水生化處理系統中分離具有纖維素分解能力的耐堿細菌，分析其物種多樣性及纖維素分解酶活性，為生物法處理堿性、纖維素含量高的廢水提供菌株。[方法]采用4種特異性堿性培養基分離耐堿細菌，采用剛果紅染色法對其中纖維素分解菌進行篩選，通過16S rRNA基因序列分析和生理生化試驗對纖維素分解細菌進行初步分類鑒定，采用DNS法對其進行酶活測定。[結果]從各類樣品中分離出50株耐堿細菌，篩選出12株纖維素分解細菌，其中有7株芽孢桿菌（Bacillus）、2株涅斯捷連科氏菌（Nesterenkonia）、1株耐鹽短桿菌（Brevibacterium halotolerans）、1株假單胞菌（Pseudomonas）、1株另類希滅氏菌（Alishewanella），大部分菌株的最適pH為11～12，且具有良好的耐鹽性和纖維素分解酶活力。菌株49228和49239分別與Nesterenkonia flava CAAS 251（T）、Pseudomonas indoloxydans IPL-1（T）的最大相似性為97.71%和98.5%，疑似為潛在的新物種。[結論]該結果初步明確了棉漿廢水生化處理系統中的堿性細菌為優勢種群，嗜堿纖維素分解菌的獲得可為生化法處理纖維素含量高的堿性廢水處理提供優勢菌株。

關鍵詞 棉漿廢水;纖維素分解細菌;篩選;鑒定;嗜堿細菌;酶活分析

中圖分類號 Q93? 文獻標識碼 A

文章編號 0517-6611（2022）12-0016-05

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2022.12.004

開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Screening，Identification and Enzymatic Activity Analysis of Alkalophilic Cellulose Decomposing Bacteria

ZHANG Yue-feng1，L Ling-ling1，ZHANG Hai-shen2 et al

（1.College of Agriculture and Food Engineering，Baise University，Baise，Guangxi 533000;2.College of Life Sciences，Tarim University，Alar，Xinjiang 843300）

Abstract [Objective]To isolate alkali-resistant bacteria with cellulose decomposition ability from some samples of a cotton pulp wastewater biochemical treatment system in Xinjiang，and analyze their species diversity and cellulose decomposition enzyme activities，these strains could be used for biological treatment of wastewater with high alkaline and cellulose content.[Method]Four kinds of specific alkaline media were used to isolate alkali-tolerant bacteria，Congo red staining were used to screen the cellulolytic strains，and 16S rRNA gene sequence analysis and physiological and biochemical experiments would be used to identify taxonomy of cellulose-decomposing bacteria，and the cellulase activity of these strains were determined by DNS method.[Result]Fifty strains of alkali-resistant bacteria were isolated from various samples，and 12 strains of cellulolytic bacteria were screened，including 7 strains of Bacillus，2 strains of Nesterenkonia，1 strain of Brevibacterium halotolerans，1 strain of Pseudomonas，1 strain of Alishewanella，the optimum pH of most strains was 11-12，and had good salt tolerance and cellulolysis enzyme activity.Among them，Similarity of 49228 and 49239 to Nesterenkonia flava CAAS 251（T） and Pseudomonas indoloxydans IPL-1（T） was 97.71% and 98.5% respectively，they might be potential new species.[Conclusion]The research showed that alkaline bacteria are the dominant species in the treatment system of cotton pulp wastewater，those alkalophilic cellulose-decomposing bacteria can be used as engineering strains for treatment of alkaline wastewater with high concentration of cellulose.

Key words Cotton pulp wastewater;Cellulose decomposing bacteria;Screening;Identification;Alkophilic bacteria;Enzyme analysis

棉漿黑液是以棉短絨為原料生產棉漿粕過程中產生的高污染的廢水，其中含有大量的纖維素、木質素、半纖維素等有機污染物，該廢水具有堿性高、色度大、難降解的特點[1]，其如何深度處理已成為人們普遍關注的問題之一。目前，對棉漿黑液的處理主要采用生物法或者以生物法為核心的耦合工藝，如生物活性炭纖維法[2]、超聲-生物法[3]和生化-物化組合工藝[4]等。在這些工藝中，微生物的種類及代謝活性高低是決定廢水處理效率高低的關鍵因素，基于棉漿黑液具有堿性高、纖維素含量高的重要特點，從某些特定樣品中篩選具有分解纖維素活性的高效嗜堿細菌具有重要價值。有研究表明，棉漿黑液中蘊含著大量嗜堿微生物，如文金麗等[5]以棉漿黑液為細菌分離培養基，從某化纖廠黑液生物處理系統中分離到16株嗜堿細菌，經鑒定這些菌株主要為產芽孢的革蘭氏陰性細菌。

嗜堿細菌是一類存在于鹽堿土壤或水體等環境中，在高pH或高鹽條件下能夠穩定生長的一類微生物[6-7]。由于長期的環境選擇壓力使嗜堿細菌演化形成了特殊的生物結構、生理機能和遺傳基因，從而對鹽堿環境的脅迫表現出良好的適應性，此外，還可以產生多種堿性酶和其他生物活性物質，是研究生物進化、生命起源和生物多樣性的重要材料，也是一類極具應用前景的極端環境微生物資源[8-9]，可廣泛應用于洗滌劑工業[10]、紡織[11]、造紙[12]、污水處理[13]等領域。因此該研究從棉漿黑液生物處理系統的水樣和泥樣中分離嗜堿細菌，然后篩選具有代謝纖維素能力的活性菌株，并進行菌種初步鑒定及酶活性測定分析，以期為嗜堿纖維素分解細菌的挖掘以及在堿性難降解廢水處理中的應用提供菌株資源和參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品。采集新疆阿拉爾市某棉漿廠的棉漿黑液、生化池水樣和生化池泥樣。這3類樣品的特點是色度高，含有的主要污染物為纖維素、木質素及其水解產物，其中棉漿黑液的堿性最高（pH約為12.0）、纖維素含量最大，生化池水樣和泥樣的酸堿性接近中性（pH約為6.5）、纖維素較低。樣品采集過程均嚴格按照無菌操作進行。

1.1.2 嗜堿細菌分離培養基。下列培養基為系列pH不同的培養基。①改良培養基一號：棉漿黑液+15%瓊脂，pH 12～13，121 ℃滅菌30 min。②改良培養基二號：生化池水樣+15%瓊脂，pH 12～13，121 ℃滅菌30 min。③馬鈴薯-蔗糖培養基：馬鈴薯200.0 g（切塊于1 L水中煮沸15 min，過濾的萃取液），蔗糖20.0 g，瓊脂15.0 g，定容于1 L容器中，pH 7～13，121 ℃滅菌30 min。④LB固體培養基：酵母提取物5.0 g，胰蛋白胨10.0 g，NaCl 10.0 g，瓊脂粉18.0 g，pH 7～13，121 ℃滅菌30 min。⑤LB液體培養基：酵母提取物5.0 g，胰蛋白胨10.0 g，NaCl 10.0 g，pH 7～13，121 ℃滅菌30 min。

1.1.3 纖維素分解細菌篩選培養基。羧甲基纖維素10.0 g，MgSO4 1.0 g，KNO3 1.0 g，K2HPO4 0.3 g，NaCl 0.5 g，酵母粉2.0 g，瓊脂 15.0 g，定容于1 L容器中，pH 7～13，121 ℃滅菌30 min。

1.1.4 生理生化試驗培養基。酵母提取物5.0 g，胰蛋白胨10.0 g，瓊脂粉18.0 g，定容于1 L容器中，根據培養條件調節不同pH和NaCl濃度，121 ℃滅菌30 min。

1.1.5 主要儀器與設備。LXJ264201型離心機（北京醫療儀器修理廠）;LDZX-50KB立式電熱壓力蒸汽滅菌鍋（上海申安醫療器械廠）;DNP-9162型電熱恒溫培養箱（上海精宏實驗設備有限公司）;MycyclerTM Thermod Cycler PCR儀（美國Bio-Rad公司）;HYA恒溫搖床（中國科學院武漢儀器廠）;SW-CJ-2F 超凈工作臺（上海博訊實業有限公司）;LGJ-10C型冷凍干燥機（北京四環科學儀器廠）。

1.1.6 主要試劑。DNS試劑，采用文獻[14]中方法進行配制。CMC緩沖液：稱取1.0 g CNC-Na溶于pH=9的緩沖液中（100 mL），沸水浴加熱至溶化，冷卻，過濾，取濾液50 mL，加pH=7緩沖液10 mL，混勻。剛果紅染液：精確稱取2.5 g剛果紅溶于100 mL燒杯中，定容在250 mL容量瓶。

1.2 方法

1.2.1 嗜堿細菌的篩選分離、純化及保藏。稱取不同的土樣10 g，分別放入盛90 mL帶有玻璃珠的無菌生理鹽水中，在搖床上振蕩約3 h。將土壤懸浮液和水樣進行梯度稀釋，選10-2、10-3和10-4稀釋度樣品涂布于上述分離培養基平皿，每個平皿接種100 μL，分離培養基pH分別為7、8、9、10、11、12，每個稀釋度設3個重復。培養皿于28 °C倒置培養2～5 d后觀察菌落生長情況，挑取單菌落至LB固體培養基上純化。對純化的細菌進行編號并于30%甘油中-20 °C保藏。

1.2.2 菌株16S rRNA基因測序和序列分析。采用CTAB（cetyltrimethylammonium ammonium bromide）法提取細菌總DNA，16S rRNA基因的PCR擴增和測序引物均為通用保守引物27F和1492R，測序工作由上海生物工程有限責任公司完成。將分離菌株的16S rRNA基因序列與GenBank數據庫中的已知序列進行BLAST比對，確定菌株分類地位。

1.2.3 產纖維素酶細菌的篩選。將供試菌株用點接法接種于加1%羧甲基纖維素鈉培養基平板上，37 ℃培養7～10 d，用1%的剛果紅染色10 min，菌落周圍有透明圈的為陽性，即為可以產生纖維素酶的菌株[15]。

1.2.4 菌株生理生化及形態學觀察鑒定。

（1）活化菌株。利用三線法將12株細菌接種在LB固體培養基內，進行培養2～3 d。

（2）菌株對鹽濃度的耐受性。制作鹽濃度為0、5%、10%、15%、20%、25%的LB液體培養基，分別將12株細菌接種于培養基內，48 h后觀察測定吸光度。

（3）菌株對pH的耐受性。制備緩沖溶液pH為4、5、6、7、8、9、10、11、12、13的LB液體培養基，將12株菌接種在培養基內，48 h后觀察測定吸光度。

（4）菌株對溫度的耐受性。將12株菌接種于LB液體培養基內，放入溫度為10、15、20、25、30、37、40、50 ℃培養箱內進行溫度試驗，48 h后觀察測定吸光度。

（5）菌株形態學觀察。將12株于37 ℃下培養48 h后的菌株置于顯微鏡下，進行形態觀察并拍照。

1.2.5 纖維素分解細菌CMC酶活的測定。

1.2.5.1 葡萄糖標準曲線的繪制。取11支10 mL的比色管，0～10號試管分別加入0～1.0 mL葡萄糖標準溶液（1 mg/mL），搖勻后加入2 mL DNS試劑，沸水浴5 min，冷卻至室溫再用蒸餾水定容至10 mL，搖勻后在波長為520 nm下測定吸光度（以1號比色管中的空白樣為對照）。以葡萄糖含量（mg）為橫坐標、吸光度為縱坐標繪制葡萄糖標準曲線。

1.2.5.2 酶活測定方法。將纖維素分解菌接種于50 mL培養基中，于37 ℃搖床培養48 h，在4 ℃、10 000 r/min離心20 min 除去菌體，取上清液作為粗酶液。具體測定方法參照文獻[14]。

2 結果與分析

2.1 嗜堿細菌的分離 對棉漿黑液、生化池泥樣、生化池水樣3種樣品中的菌落進行分離、純化后，共得到50株嗜堿細菌，詳細情況見表1。由表1可知，棉漿黑液中共分離到31株嗜堿細菌，占總數的62%;生化池水樣中共分離得到13株嗜堿細菌，占總數的26%;生化池泥樣中分離得到6株嗜堿細菌，占總數的12%。由此可見，棉漿黑液生物處理系統中含有豐富多樣的嗜堿細菌，是嗜堿細菌分離的優良場所，這些嗜堿細菌可作為堿性廢水生物處理法的菌種。

上述所分離得到的嗜堿細菌大部分來自棉漿黑液中，這可能是由于細菌長期適應強堿性棉漿黑液的結果。而生化池水樣和泥樣中盡管微生物種類豐富，但這2種環境均為弱酸性或堿性，故嗜堿細菌較少。

2.2 纖維素分解細菌的篩選

2.2.1 纖維素分解細菌的初篩。利用羧甲基纖維素鈉的培養基，對所得到的50株菌株進行纖維素分解能力的初步篩選，詳細結果如表2所示。由表2可知，50株細菌中共篩選出12株具有分解纖維素能力的細菌，分別是49011、49082、49208、49209、49210、49228、49232、49239、49243、49252、49261、49267，占菌株總數的24%。由此可見，棉漿黑液生物處理系統中含有豐富的嗜堿纖維素分解細菌。

2.2.2 纖維素分解細菌的復篩。利用羧甲基纖維素鈉培養基，對初步篩選的12株具有分解纖維素能力的細菌進行進一步復篩，測定其分解纖維素能力的強弱。以得到的透明圈直徑作為參考條件，詳細結果見表3，部分纖維素分解能力如圖1所示。

由表3可知，纖維素分解細菌的復篩結果與初篩結果是一致的，上述12株細菌均具有良好的分解纖維素能力，其中有10株細菌的透明圈直徑超過了20 mm，占總數的83%。其中7株來源于棉漿黑液中，進一步說明棉漿黑液是分離嗜堿纖維素分解細菌的優良場所。

2.2.3 供試菌株測序。將12株具有分解纖維素能力的細菌DNA進行PCR擴增后進行測序，得到測序結果。將菌株測序結果與BLAST數據庫已知種進行比對后結果見表4，結果顯示其中有7株芽孢桿菌（Bacillus），包括6株耐鹽芽孢桿菌（Bacillus halodurans）和1株沙福芽孢桿菌（Bacillus safensis），共占檢測細菌的58%;2株涅斯捷連科氏菌（Nesterenkonia），占檢測細菌的17%;1株耐鹽短桿菌（Brevibacterium halotolerans）;1株假單胞菌（Pseudomonas）;1株另類希滅氏菌（Alishewanella）。其中菌株49228和49239與已知菌的相似性較低，分別為97.71%和98.50%，為潛在新物種。從棉漿黑液中分離的菌株多以革蘭氏陽性桿菌為主，占總數的48%。

2.3 生理生化試驗

2.3.1 菌株對pH的耐受性。Horikoshi[16]根據耐受堿的程度不同，將在pH 10～12最適或生長良好，但在pH 6.5左右不能或僅能緩慢生長的稱為嗜堿細菌。在pH≥10.0最適生長，且pH低于8.0時不生長的為專性嗜堿細菌;在pH≥10.0最適生長，且在中性環境中也能生長的為兼性嗜堿細菌;能在pH 7～9生長，但在pH≥10.0不能生長為耐堿細菌。

對12株纖維素分解細菌的pH耐受性試驗結果（表5）顯示，所有菌株都只能在堿性條件下生長，故均為嗜堿細菌，其中49228、49232、49243、49239、49252、49261為專性嗜堿細菌，49011、49082、49208、49210、49267為兼性嗜堿細菌，無耐堿細菌。可見上述所有菌株對堿性環境均表現出較強的偏嗜性和適應性，其中大部分菌株的最適pH在10～12，這些菌株具有耐極端堿的特性。

2.3.2 菌株對溫度的耐受性。從表6可以看出，所有菌株都可以在15～37 ℃的環境中生長，都不能在40 ℃以上的環境中生長。可見菌株對環境的依賴性不是很高，在常溫下均能夠正常生長。可能由于該菌株長期在自然溫度中受到馴化，所以室外溫度中都能正常生長繁殖。

2.3.3 菌株對鹽濃度的耐受性。對12株菌進行鹽濃度耐受試驗，結果顯示（表7），供試菌株均可在0～10%鹽濃度條件下正常生長，表現出對氯化鈉的良好耐受性，而49208、49209、49210、49228對鹽濃度耐受能力更強，可達到20%，按照嗜鹽細菌分類劃分，其中49208、49209、49210、49228、49243、49261為中等嗜鹽細菌。可見這些菌株不僅表現出良好的耐堿性同時還表現出良好的耐鹽性，可用于鹽堿度均高的環境領域。

2.4 葡萄糖標準曲線 從圖2可以看出，葡萄糖標準曲線方程為y=0.7x（R2=0.999），可見葡萄糖濃度在0～1.0 mg/mL與吸光度線性相關性很好。2.5 纖維素酶學特性分析 從菌株纖維素酶活測定結果（表8）可以看出，總體來講，上述12株菌均具有較高的纖維素酶活力，具有較強的分解纖維素能力，其中49011、49082、49239、49208、49243這5株菌的酶活均在30 U以上，具有重要的應用研究價值。

3 結論與討論

該研究從棉漿黑液的各個生物處理工段的水樣和泥樣

中共分離獲得了50種嗜堿細菌，從形態等特征結構分析，這些菌株具有良好的物種多樣性。其中12株具有明顯的纖維素分解能力，占總細菌數的24%，說明棉漿黑液是分離嗜堿纖維素分解細菌的良好場所。對12株纖維素分解細菌的生理生化試驗和16S rRNA鑒定結果顯示，這些菌以芽孢桿菌為主，同時具有良好的耐鹽特性，其中有2株菌與已知菌相似度較低，為潛在新物種，具有一定后續研究價值。12株細菌的纖維素酶活結果顯示，這些菌株都可以產生纖維素分解酶，絕大部分都具有較高的酶活力，可見這些菌株可以很好地利用纖維素。該研究結果初步明確了棉漿廢水生物處理系統中嗜堿細菌的組成和分布，這些菌株的獲得可為鹽堿度較高、纖維素含量較高的難處理廢水的深度處理提供菌種資源，具有較高的工業應用價值。

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