QuEChERS-超高效液相色譜-串聯質譜法同時檢測草莓中4種農藥殘留量

杜 鑫，彭海燕，覃明麗，陳紹輝，易珊珊，蔣金芳

(南充農產品質量監測檢驗中心，四川 南充 637000)

草莓酸甜美味，果肉色澤紅潤，富含豐富的蛋白質、維生素、糖分、有機酸、食物纖維及礦物質等多種營養物質，深受消費者喜愛，已成為廣大市民最普遍食用的水果品種[1]。草莓主要以大棚覆膜種植技術為主，棚內高溫高濕環境極易引起病蟲害的發生，降低草莓的品質和產量。噻螨酮、唑螨酯、噻嗪酮、阿維菌素等殺蟲殺螨劑具有選擇性強、速效性好、持效期長及對蜜蜂無不良影響等特點，已用于多種植物上防治紅葉螨、全抓蟠和其他植食性螨類，可用于防治大棚草莓生長過程中的白粉病、霜霉病、二斑葉螨、小菜蛾及紅蜘蛛等病蟲害[2-4]。

目前，針對果蔬中農藥多殘留的檢測方法主要有氣相色譜法[6]、氣相色譜—串聯質譜法( GC-MS/MS)[7-8]、液相色譜法[9-10]、液相色譜—串聯質譜法(LC-MS/MS)[4-5]，但氣相色譜法和液相色譜法易受雜質干擾，且前處理繁瑣，GC-MS/MS常用于分析弱極性且具有一定揮發性的農藥，不適用于檢測諸如阿維菌素等難以氣化的高沸點物質。超高效液相色譜-串聯質譜法(UPLC-MS/MS) 具有高分辨、抗干擾能力強及高靈敏度等優點，QuEChERS被廣泛應用于樣品基質的提取、凈化，具有操作簡易、溶劑用量少、分析速度快等優點，兩者結合應用已成為農藥和獸藥多殘留分析的主導技術[11-12]。

1 實驗部分

1.1 主要儀器與試劑 Waters ACQUITY UPLC H-Class/Xevo TQ-S超高效液相色譜串聯質譜儀，GD16plus高速研磨均質儀，H2100R 落地式高速冷凍離心機，Multi Reax全能型振蕩器、ML802型分析天平，3-18KS型高速冷凍離心機，Vortex Genius 3型旋渦混合器，JB3060食品調理機。

甲醇、乙腈、甲酸、乙酸銨均為色譜純，QuEChERS分散萃取試劑盒(5982-5056)及萃取鹽包(5982-0032)。噻螨酮、唑螨酯、噻嗪酮、阿維菌素等4種農藥標準溶液，濃度均為1 000mg/L。15/50mL離心管，PTFE 0.22μm針筒式微孔濾膜，蒸餾水。

1.2 樣品制備 草莓(紅顏、巧克力、奶油、紅玉等)，取有代表性的草莓全果(去柄)樣品，采用四分法縮分后約1kg，放入料理機中，高速勻漿均質后裝入潔凈的聚乙烯塑料樣品盒中，密封后于-20 ℃冰箱保存(使用前先解凍至室溫)。

1.3 樣品提取 準確稱取10g(精確至0.01g)勻漿后的草莓樣品于50mL離心管中，依次加入1顆陶瓷均質子，10.00mL乙腈，一袋萃取鹽包，擰緊離心管蓋，放入低溫(5℃)高速研磨均質儀中3 000r/min均質提取3min，然后5 000r/min離心3min，取上清液待凈化。

1.4 樣品凈化 吸取5mL上清液加到內含900mg MgSO4+150mg PSA塑料離心管中，振蕩渦旋2min，5 000r/min離心3min，吸取2mL上清液過0.22μm微孔濾膜后裝瓶，待上機測定。

1.5 儀器檢測條件

1.5.1 色譜條件 Waters XBridge C18色譜柱(3.5μm，100mm×3.0mm)，柱溫40℃，樣品室溫度為18℃，進樣體積為1.00μL；選用甲醇(A)、水(含0.10%甲酸—5mmol/L乙酸銨)(B)及乙腈(C)作為流動相，按(表1)中的流動相梯度洗脫程序分離目標物。

1.5.2 質譜條件 電噴霧離子源的溫度為150℃，毛細管電壓為3.0kV。脫溶劑氣和錐孔氣均為高純氮氣，脫溶劑氣流量為1 000L/h，其溫度為550℃，錐孔氣流量為150L/h，碰撞氣用高純氬氣，其流量為0.14mL/min。采用電噴霧正離子模式(ESI+)和選擇多反應監測(MRM)模式采集數據，質譜儀信號采集時間段為3.5～8.5min，利用質譜已在線切換閥將其他時間段的液相色譜流動相切換到廢液，降低質譜檢測器污染。

表1 超高效液相色譜流動相梯度洗脫程序

1.6 標準溶液的配制 準確移取各農藥標準溶液，用色譜級乙腈逐級稀釋成濃度為10mg/L標準儲備液，于4℃下避光儲存(使用前放至室溫)。將篩選出的草莓空白樣品按前處理方法制成基質空白溶液，用該溶液逐級稀釋10mg/L混合標準溶液，配制成質量濃度為0.005、0.010、0.050、0.10、0.20mg/L一系列匹配標準工作溶液。

2 結果與分析

2.1 色譜-質譜條件優化 將4種農藥分別用乙腈-水(1：1，V：V)配制成0.5mg/L濃度的單一標準溶液。選取甲醇(A相)、水(B相)和乙腈(C相)為流動相。在ESI+電離模式下，為提高4種農藥的電噴霧離子化效率，采取向水相中加入少量甲酸和乙酸銨。

表2 4種農藥的UPLC-MS/MS質譜分析參數

采取質譜進樣，在ESI+模式下，手動優化毛細管電壓，錐孔電壓等，結合不同流動相體系對4種農藥進行了全掃描，分析目標物響應信號強度，結合儀器“Intellistart”功能快速優化出的質譜分析參數(表2)。試驗發現，在酸性條件下，阿維菌素的準分子離子主要以[M+Na]+形式出現，可能是因為其分子結構中的醚鍵及羰基上的氧易與Na+結合，整個流路體系中極少的Na+都會與之結合形成[M+Na]+峰[5]，其余3種農藥[M+H]+離子峰響應信號較強，將其作為母離子，每種農藥篩選出2個響應信號強且沒有干擾的子離子，并選用響應信號最強的分子離子對作為定量離子對。

采用色譜進樣，為提高目標物分離效果和改善峰形，在0.1%甲酸-水溶液中加入乙酸銨緩沖液，考察其濃度在1～10mmol/L范圍變化對目標物的影響。當乙酸銨濃度太低時，不能有效調整峰形，太高了又會抑制目標物的電離，降低靈敏度。當加入5mmol/L乙酸銨時，改善峰形和提高靈敏度的效果最好，優選后的流動相色譜條件(表1)，4種農藥的試劑標準溶液MRM色譜圖(圖1)。結果表明，在優化后的色譜和質譜檢測條件下，采用甲醇-乙腈-水體系，目標物均在10min內出峰，加入少量甲酸和乙酸銨后，目標物都有較強的分子離子峰強度，峰形對稱，有效提高了檢測方法的穩定性、靈敏度和選擇性。

圖1 4種農藥的試劑標準溶液MRM色譜圖(0.050mg/L)

2.2 提取劑選擇 草莓中有糖類、色素、維生素、有機酸及大量水分，為更充分地提取待測藥物，試驗選用能與水互溶的乙腈和甲醇為提取劑。經多次試驗嘗試發現，甲醇的提取效果雖不錯， 但沒有有效的方法能夠分離草莓中的大量水分，而乙腈對不同極性農藥均有較好的提取效果， 對試樣中油脂和色素類雜質的溶解度較小，利用鹽析法又能與水兩相分離，還可以除掉草莓樣品提取液中的糖類、有機酸物及維生素等大部分雜質，有利于下一步凈化提取液，減弱樣品基質干擾，降低基質效應影響。經優化后，選用10.00mL乙腈為提取劑。

2.3 QuEChERS 凈化方法的選擇 QuEChERS主要以N-丙基乙二胺(PSA)、石墨化碳(GCB)和十八烷基鍵合硅膠(C18)等填料為固相吸附劑，固相填料的組成及含量是決定樣品凈化效果的主要因素。PSA有比氨基柱更強的離子交換能力，可與金屬離子產生螯合作用，廣泛用于植物農殘分析，去除脂肪酸、有機酸、極性色素和金屬離子等。GCB主要用于吸附除去樣品提取液的大量色素，同時也會對提取液中類似于平面型結構的農藥分子有吸附，導致回收率大幅降低。C18主要用于除去脂肪類等非極性化合物。因草莓樣品中脂肪含量極少，本實驗未選用C18填料，直接選用PSA及PSA+GCB組合的兩種凈化管。選取空白草莓(紅顏)為基質，添加農藥含量為0.050mg/kg，乙腈提取后離心，吸取5mL上清液，加入以900mg MgSO4+150mg PSA和885mg MgSO4+150mg PSA+1mg GCB為固相分散劑的15mL凈化離心管，渦旋振蕩2min，離心后過濾膜上機，計算分析加標回收率來考察凈化效果，結果(圖2)。

圖2 不同凈化填料對目標物回收率的影響

結果表明：僅用PSA凈化提取液時，4種農藥的回收率均接近100%，回收率很好。用PSA+GCB凈化后，阿維菌素的回收率降低為76.9%，這是因為阿維菌素是一種含有十六元大環的內酯化合物，易被GCB填料吸附導致。另外，在前處理過程中也發現，經 PSA 凈化后的提取液已經變為無色，因此不需要再加入GCB去除色素。綜合考慮，用900mg MgSO4+150mg PSA填料凈化管處理樣品，草莓基質空白及基質標液MRM色譜圖(圖3)和(圖4)，凈化后的基質空白不干擾試樣中的目標物測定，目標物響應良好，峰形對稱且無雜質，滿足定性定量分析要求。

圖3 草莓空白基質MRM色譜圖

圖4 4種農藥的基質標準溶液MRM色譜圖(0.050mg/L)

2.4 基質效應的影響 基質效應(微乳劑)是液質聯用檢測方法檢測中普遍存在的現象，指樣品中目標分析物的濃度或者質量檢測受一種或多種不被檢測成分影響的現象，可能是因為電噴霧離子化效率易受樣品基質或色譜分離中的共流出物影響了待測成分的離子化效率，從而導致目標物響應信號的改變，產生基質增強或基質抑制效應[13]。用乙腈試劑和不同空白草莓基質溶液配制相同濃度的農藥溶液，采用色譜進樣來獲得目標物的定量離子色譜峰面積，以試劑標的峰面積為標準來計算基質標中農藥基質效應的相對強度，結果(圖5)。4種農藥在不同草莓樣品間的微乳劑值在0.98～1.12，基質效應略微增強，不同草莓空白基質間的差異很小，可忽略不計。為使定量結果更準確，采用了反相高效液相色譜法洗脫分離目標化合物，減少共流出物，降低了基質干擾，同時采用基質匹配標準溶液校正方法對基質效應進行補償。

圖5 4種農藥在草莓基質中的微乳劑

2.5 方法的線性范圍和檢出限 用空白草莓基質溶液配制4種農藥的混合標準溶液，以每種農藥的質量濃度(x， mg/L)為橫坐標，定量離子對的色譜峰面積(y)為縱坐標，繪制標準曲線，詳細結果(表3)，線性相關系數r均>0.998 6。用Masslynx V4.1軟件計算信噪比(S/N)，并以S/N=3計算得到了方法的檢出限為1.2～2.0μg/kg。

表3 4種農藥的基質匹配標準曲線、線性相關系數及檢出限

2.6 方法的回收率、精密度與定量限 以空白草莓樣品為基質，添加0.010、0.050、0.10mg/kg 3個濃度水平混標，每個添加水平重復測定 6次，做樣品加標回收率試驗。為模擬實樣檢測過程，稱樣后加入4種農藥混標，渦旋1min，密封過夜，待樣品充分吸收農藥后，次日按照1.3～1.6節方法進行樣品前處理及上機檢測，數據結果(表4)。4種農藥的定量限均為0.010mg/kg，平均添加回收率為85.2%～108.2%，相對標準偏差(RSD)為2.8%～5.9%，回收率和精密度符合農藥殘留檢測的要求[14]。

表4 草莓樣品添加回收率和精密度(n=6)

續表

2.7 實樣檢測 按本方法對40個草莓樣品進行檢測分析，每個樣品做平行雙樣，發現目標農藥的檢出率僅為5%，共有2批草莓中檢出含有目標農藥，分別為阿維菌素和噻嗪酮，但都沒有超過國內外最大允許殘留限量值[15]。

3 結論

建立了QuEChERS 前處理方法結合 UPLC-MS/MS 檢測草莓中噻螨酮、唑螨酯、噻嗪酮、阿維菌素等4種農藥殘留的方法。采用基質匹配標準溶液外標法定量，前處理過程簡便快速、穩定性好、靈敏度高，回收率和精密度等指標均符合農藥殘留檢測的要求，適用于草莓中該4種農藥的同時快速測定。