金線蓮組培苗快速培養(yǎng)研究

王躍華，吳佳琪，王習著，胡 域,劉真珍,魏博坤,閻婷婷

(1.成都大學 食品與生物工程學院，四川 成都 610106; 2.湖北省浠水縣農業(yè)農村局，湖北 黃岡 438200)

0 引 言

金線蓮(Anoectochilusroxburghii(Wall.) Lindl.)又名金線蘭、金絲草，為蘭科開唇蘭屬多年生草本植物，具有鎮(zhèn)咳、清熱與止痛等功效[1-2].在自然環(huán)境中，金線蓮種子的萌發(fā)需要相關真菌伴生，自然萌發(fā)率較低[3]，而且金線蓮的適應性較差，對生長環(huán)境要求十分苛刻.近年來，人為過量采挖，造成金線蓮植物賴以生存的環(huán)境條件被破壞，野生金線蓮資源銳減[4].本研究采用生物工程的組織培育技術，篩選出金線蓮愈傷誘導組織、不定芽誘導分化和無根苗壯苗生根的最佳培養(yǎng)基配方，最終建立金線蓮再生植株的快速繁育體系，為金線蓮植物的快速繁殖及大規(guī)模栽種提供理論依據(jù)及技術支持.

1 材料與方法

1.1 材 料

實驗所用金線蓮采自四川省都江堰市，經鑒定為蘭科(Orchidaceae)開唇蘭屬的金線蓮(Anoectochilusroxburghii(Wall.) Lindl.).

1.2 方 法

1.2.1 不同外植體誘導愈傷組織

選取生長健壯的金線蓮植物，放在超凈工作臺上用75%乙醇消毒10 s后，用無菌水沖洗3次，再放入0.1%的氯化汞中消毒8 min后，用無菌水沖洗3次，吸干水分后，切取葉柄、葉片、根、莖和芽各器官作為外植體，接入1/2 MS +NAA 0.6 mg/L+6-BA 1 mg/L的培養(yǎng)基中進行愈傷組織誘導.

1.2.2 不同激素配比對葉柄誘導愈傷組織的影響

以金線蓮葉柄為外植體，采用L9(33)正交試驗進一步篩選出不同激素配比對葉柄誘導愈傷組織的影響，具體因素水平見表1.

表1 誘導愈傷組織因素水平表

1.2.3 不同激素對愈傷組織誘導分化不定芽的影響

選取由“1.2.2”項下葉柄誘導獲得的質地較緊致愈傷組織，將其切成0.5 cm3大小接種到表2誘導不定芽的培養(yǎng)基中進行誘導培養(yǎng).

表2 誘導不定芽因素水平表

1.2.4 不同激素對無根苗壯苗生根的影響

選取由“1.2.3”項下培養(yǎng)的生長1.5～2 cm的不定芽為無根苗，接入以1/2 MS+活性炭1 g/L為基本培養(yǎng)基，并分別添加了不同濃度的6-BA和NAA，在溫度為(23±2)℃，光照強度為1 500～2 000 lx和光照時間為12 h/d的條件下誘導生根培養(yǎng).

1.2.5 煉苗與移栽

在培養(yǎng)室中，將組培瓶蓋打開放置12 h后，選取生長有3～5片葉，苗高在4 cm以上的組培苗，用水沖洗掉根部的培養(yǎng)基后，移栽到育苗盆中，在溫度(20±2)℃，相對濕度在90%左右和光照強度為400 lx的條件下培養(yǎng).

1.3 計算方法

愈傷組織誘導率=(誘導愈傷組織數(shù)/接種外植體數(shù))×100%

不定芽誘導率=(產生不定芽數(shù)/接種外植體數(shù))×100%

生根率=(生根數(shù)/接種數(shù))×100%

存活率=(存活的外植體數(shù)/移栽組培苗數(shù))×100%

2 結果與分析

2.1 不同外植體誘導愈傷組織

采用葉片、葉柄、根、莖和芽作為外植體，接入在1/2 MS +NAA 0.6 mg/L+6-BA 1 mg/L的培養(yǎng)基中，培養(yǎng)40 d后統(tǒng)計愈傷組織誘導率結果見表3.

表3 不同外植體誘導愈傷組織結果

由表3可知，以上5種外植體中，僅有葉柄和莖能誘導出愈傷組織，而其他部位的外植體都未能成功誘導出愈傷組織.

通過觀察可知，各外植體接入培養(yǎng)基后，隨著培養(yǎng)時間的增加，出現(xiàn)了各種不同的情況.首先根外植體在接入培養(yǎng)基4 d后就出現(xiàn)了褐化情況，隨著培養(yǎng)時間的延長，根外植體褐化嚴重逐漸開始死亡；芽外植體接入培養(yǎng)基后，沒有出現(xiàn)愈傷化進一步產生愈傷組織，而表現(xiàn)出明顯的抽芽現(xiàn)象；葉片接入培養(yǎng)基后，最初出現(xiàn)葉緣卷曲現(xiàn)象，但隨著培養(yǎng)時間的增加，葉片外植體變黃逐漸產生死亡；莖外植體在接入培養(yǎng)基13 d后，在莖著生葉的節(jié)處開始產生白色的愈傷組織，隨著培養(yǎng)時間延長，愈傷組織顏色由白色逐漸變?yōu)榫G色，培養(yǎng)40 d后統(tǒng)計愈傷組織的誘導率為20.3%；葉柄外植體在接入培養(yǎng)基10 d后，從葉柄的兩端開始膨大，培養(yǎng)40 d后統(tǒng)計愈傷組織的誘導率為32.5%.

2.2 不同激素配比對葉柄誘導愈傷組織的影響

在超凈工作臺上，將消毒后的金線蓮葉柄接入以1/2 MS為基本培養(yǎng)基，添加了不同濃度的NAA、ZT 和6-BA 組成的三因素三水平培養(yǎng)基中，培養(yǎng)50 d后統(tǒng)計結果見表4.

表4 不同激素配比誘導葉柄產生愈傷組織結果

由表4可知，不同濃度激素配比對葉柄愈傷組織誘導有明顯的影響作用.A8組培養(yǎng)基配方1/2 MS+NAA 0.6 mg/L+ZT 0.5 mg/L+6-BA 0.5 mg/L，在50 d后統(tǒng)計愈傷組織誘導率為95.0%，且產生的愈傷組織生長速度快，質地堅硬，如圖1所示.

圖1 葉柄誘導愈傷組織

由極差分析可知， NAA的極差值為56.67，ZT的極差值為20.00，6-BA的極差值為18.33，由此可見NAA對葉柄誘導愈傷組織的影響最顯著，3個因素中影響最大的是NAA,其次是ZT，6-BA影響最小.3個因素的方差分析見表5.

表5 方差分析表

由表5可知，在研究的3個因素中，NAA的檢驗值F=97.00，F(xiàn)0.05=19.00，F(xiàn)0.01=99.00，即F0.05F6-BA>FZT，即影響葉柄誘導愈傷組織最重要的因素是NAA，其次是6-BA，最后是ZT.

2.3 不同激素對愈傷組織誘導分化不定芽的影響

選取葉柄誘導獲得的質地緊致愈傷組織接入不定芽誘導培養(yǎng)基中，30 d后統(tǒng)計結果見表6.

由表6可知，不同激素配比對愈傷組織誘導分化不定芽的影響效果不同.B9組培養(yǎng)基配方1/2 MS+ZT 0.4 mg/L+ NAA 0.5 mg/L+6-BA 1.5 mg/L是愈傷組織誘導產生不定芽的最佳培養(yǎng)基，30 d后統(tǒng)計不定芽的誘導率達93%.通過觀察發(fā)現(xiàn)，B9組培養(yǎng)基中生長12 d后，在愈傷組織表面開始有黃白色的小芽產生，隨著培養(yǎng)時間的延長，小芽逐漸長大，顏色也由黃白色開始變?yōu)辄S綠色,培養(yǎng)30 d后小芽長出嫩綠色的葉片，如圖2所示.

表6 不定芽誘導結果

圖2 不定芽誘導產生

由表6可知，ZT的極差值為38.66，NAA的極差值為10.67，6-BA的極差值為18.00，由此可見，ZT對愈傷組織誘導分化不定芽的影響最顯著，3個因素影響大小依次是ZT>6-BA>NAA.3個因素的方差分析見表7.

表7 方差分析表

由表7可知，ZT的檢驗值F=109.16，F(xiàn)0.01=99.00，檢驗值F>F0.01，說明ZT對不定芽誘導有極顯著影響(P<0.01)；6-BA的檢驗值F=19.70，F(xiàn)0.05=19.00，F(xiàn)0.01=99.00，即F0.05

綜合各因素的檢驗值分析，可以得出對不定芽誘導最顯著的因素是ZT，其次是6-BA，此結果與極差分析結果一致.

2.4 不同激素對無根苗壯苗生根的影響

切取生長1.5～2 cm的不定芽為無根苗，接入壯苗生根培養(yǎng)基中，30 d后統(tǒng)計結果見表8.

表8 無根苗生根培養(yǎng)結果

由表8可知，C1(對照組)在培養(yǎng)基中不添加任何激素的情況下，培養(yǎng)30 d后統(tǒng)計生根率最低僅為43.3%，這說明在培養(yǎng)基中添加NAA和6-BA兩組激素對無根苗的壯苗生根具有不同程度的促進作用.C3組(NAA濃度為0.3 mg/L)和C6組(6-BA濃度為0.3 mg/L)的生根率都是最高，分別為100%和93.3%，其中激素NAA對生根的促進作用強于6-BA.

C3組不定芽接入培養(yǎng)基10 d后，在金線蓮無根苗的下部節(jié)處開始長出帶有白色絨毛的不定根，并隨著培養(yǎng)時間的延長，不定根快速生長，插入培養(yǎng)基中，其顏色也逐漸變?yōu)辄S綠色，如圖3所示.

圖3 培養(yǎng)基C3組培苗

本實驗結果可知，金線蓮不定芽壯苗生根的最佳培養(yǎng)基是1/2 MS+活性炭1 g/L+NAA 0.3 mg/L，培養(yǎng)40 d統(tǒng)計生根率為100%，且組培苗長勢健壯.

2.5 煉苗與移栽

何碧珠等[5]通過實驗研究表明，金線蓮移栽時應選用莖粗，具有2～4條根系且長勢優(yōu)良的植株，不但能有效提高植株對外界的適應性，還能保證較高的成活率.本研究選取根和莖生長健壯，并長有3～5片葉，且苗高在4 cm以上的組培苗，用水沖洗掉根部的培養(yǎng)基后，移栽到裝有草炭泥和鋸末(1∶1)組成的育苗盆中，在溫度(20±2)℃，相對濕度在90%左右和光照強度為400 lx的條件下培養(yǎng).

在移栽25 d后，統(tǒng)計金線蓮苗的存活率為88%.金線蓮是典型的陰性植物，對其生長的環(huán)境(如溫度與光照等)要求較高[6].在培育時，應保持土壤適當濕潤，注意控制光照時間和強度.也有研究表明，為保證金線蓮組培苗的成活率和栽種成本，金線蓮在移栽時使用的基質以樹皮最好，因其具有較好的透氣性、表面易干和成本低等優(yōu)點[7].

3 討 論

明代《本草綱目》記載，金線蓮全草可入藥，具清熱涼血、護肝、生津養(yǎng)顏、除濕解毒與扶正固本等功效.隨著近年來對其化學成分的研究，其藥理作用也逐漸得到科研人員的重視.經大量研究發(fā)現(xiàn)，金線蓮的藥理作用包括抗腫瘤、降血糖、保肝、抗乙型肝炎病毒、免疫調節(jié)、降血壓、血管保護、抗感染和抗氧化等[8-9].

金線蓮不僅在醫(yī)療保健與美容行業(yè)等領域得到廣泛開發(fā)應用，而且由于其株型小巧美觀，因此被人們當成一種觀賞價值極高的觀葉珍品[10].為了解決金線蓮不斷擴大的市場需求量，本研究利用生物工程技術，通過誘導金線蓮植物外植體脫分化和再分化形成不定芽和不定根過程，快速地培育出大量金線蓮優(yōu)質種苗，建立金線蓮植物快速培養(yǎng)體系，解決了當前金線蓮種苗嚴重短缺的問題，為金線蓮產業(yè)健康發(fā)展提供了技術保障.