納米藥物遞送系統在結核病治療中的研究進展

田娜 褚洪遷 孫照剛

2021年世界衛生組織(WHO)全球結核病報告顯示，中國2020年的結核病患者例數占全球總數的8.5%，位居全球第二，表明結核病防治形勢仍然十分嚴峻[1]。然而，傳統的抗結核藥物治療時間長、藥代動力學差以及藥物不良反應較多導致患者依從性差，加速了耐藥菌的出現，導致耐多藥結核病(multidrug-resistant tuberculosis，MDR-TB)和廣泛耐藥結核病(extensively drug-resistant tuberculosis，XDR-TB)患者發生[2-3]。再加上至今仍缺乏全新的抗結核藥物以及對成人有效的結核病疫苗，結核病的治療重新激發了人們的興趣[4]。近年來，隨著科技的進步，尤其是納米科學的發展，納米材料的應用為醫學科學領域提供了一個新視角[5]，很多研究報道了多種基于納米材料的疾病治療手段和策略[4, 6]。作為已知抗結核藥物的載體，納米材料可以減少用藥劑量和藥物相關的不良反應，并經患者方便的途徑給藥，如肺部直接給藥或口服給藥[7-8]，擁有廣闊的應用前景[9-10]。本文將對近年來通過納米藥物遞送系統治療結核病的研究進展作一綜述。

納米藥物遞送系統及其在結核病治療中的應用

隨著納米技術的快速發展，以納米材料為載體的新的藥物遞送策略不斷涌現。納米技術是一門多學科交叉的新型技術，涵蓋了生物學、化學和物理學等學科，具體劃分為納米材料學、納米醫學以及納米化學等。其中，納米醫學在呼吸系統疾病中的應用已經成為醫學界的研究熱點[11-13]。納米粒子是一類由天然或合成的高分子材料制成的納米級固態膠體顆粒，又叫做毫微粒[14]。納米粒子主要具備以下3種基本特性：(1)尺寸效應：納米粒子的超微小體積使其可以穿過人體最小的毛細血管和血-腦屏障，進而在細胞以及亞細胞水平釋放負載的藥物[15-17]；(2)表面效應：使納米粒子表面的原子處于高能狀態并具有很強的催化活性，從而提高材料的利用率[18]；(3)隔絕作用：納米粒子可以減緩甚至消除體液中的酸、堿、鹽等介質對被包裹于載體內抗原的影響，從而有效避免喪失抗原活性，利于抗原的儲存和運輸[19-20]。鑒于上述特性，將納米材料作為藥物載體具有許多優勢，如載藥量高、可緩釋給藥以延長藥物的作用時間[21-22]、可以建立新的給藥途徑[23-24]等。納米材料的高載藥量及可緩釋給藥，降低了抗結核藥物的給藥頻率；靶向給藥可顯著提高病變組織的藥物濃度[25]，從而實現減少藥物不良反應、增加生物利用度及提高患者依從性等目標。目前，各種納米系統包括生物可降解的聚合物納米顆粒、納米乳膠、納米碳、固體脂質納米顆粒(solid lipid nanoparticles， SLN)、樹狀大分子、金屬納米顆粒、量子點、納米顆?；鞈覄?、納米樹脂材料、納米乳劑、納米囊泡等已被用于遞藥載體，其中部分納米材料已被證明臨床有效[26-37]。利用這些納米材料可以直接將抗結核藥物遞送到受感染的細胞，具有高穩定性、高載藥量、可同時加入親疏水藥物、可改變給藥途徑、延長藥物從基質釋放時間等優點。從而增強藥物的溶解度、提高藥物的包封率及生物利用度、提高靶向性、減少給藥頻率及給藥劑量[38]，并可能解決患者依從性差的問題[39-40]。

一、納米乳劑

納米乳劑是由水、油、表面活性劑和助表面活性劑以適當比例形成的一種低黏度、熱力學穩定、透明或半透明的均相分散體系[41]。根據分散相和連續相的組成及相對分布，可以將納米乳分為兩相(O/W或W/O)或多相(W/O/W)納米乳[42]。有研究表明，納米乳能夠提高難溶性藥物的溶解度及生物利用度，因而可用作藥物載體實現緩釋及靶向給藥[43-44]。Shobo等[45]合成了普托馬尼(pretomanid，PA-824)水包油納米乳劑，以改善藥物在中樞神經系統的遞送。研究結果表明經鼻腔給藥后，大鼠腦組織中的PA-824水平明顯高于規定的治療水平，質譜儀成像(MSI)也清楚地顯示了其腦組織中PA-824的均勻分布，從而證實該納米乳劑實現了靶向到腦組織，在治療顱內結核方面有廣闊的應用前景。Choudhary等[46]則制備了負載利奈唑胺的W/O納米乳劑。Wistar大鼠的體內研究結果表明，該納米乳劑經口服給藥后可以經淋巴轉運至淋巴結，具有靶向淋巴的理想特性。此外，抗菌研究結果證實了所開發的納米乳劑對恥垢分枝桿菌的抑菌活性，可以作為一種可行的淋巴結結核治療方案。而Bazán Henostroza等[47]開發了用于治療眼結核的利福平(rifampicin, RFP)陽離子納米乳劑，并利用殼聚糖和多黏菌素B進行表面修飾。研究表明該制劑可以延長藥物在眼球表面的作用時間，提高其生物利用度。同樣，Halicki等[48]也設計了一種含RFP的納米乳劑(RFP-NE)，該乳劑在體外顯示了與游離RFP相似的抗結核分枝桿菌活性，可以被認為是口服安全的，并且用納米乳劑包裹RFP還可以防止其降解，是一種很有前途的RFP替代藥物。在另一項研究中，Hussain等[49]將陽離子納米乳劑與RFP制成凝膠，通過經皮給藥治療全身和皮膚結核病。這種方法增強了藥物在皮膚中的滲透性，提高了治療效果的同時，減少了與劑量相關的不良反應。此外，皮膚刺激性研究表明，該制劑有較好的生物相容性和安全性，有望作為一種治療全身和皮膚結核的替代方案。而Burger等[50]也制備了由天然油脂和氯法齊明(Cfx)、青蒿素(ATM)和去奎寧(DQ)組成的納米乳劑。體外研究表明該納米乳劑能有效地在角質層-表皮和表皮-真皮內傳遞藥物，對人永生角質形成細胞(HaCaT)沒有起明顯的細胞毒性，而且體外對結核分枝桿菌有抑制作用，表明該乳劑可作為皮膚結核的輔助局部治療。然而納米乳劑作為藥物載體仍存在以下不足：(1)納米乳劑生產成本較高；(2)生產配方需要無毒溶劑，以確保用藥安全?？梢?，關于納米乳劑的表面功能化及安全利用還需要進一步的研究。

二、脂質體納米載體

脂質體是由磷脂雙分子層構成的內部為水相的脂質微囊，具有易于在生物體內降解、無免疫原性和無毒性等特點，還可以提高藥物靶向性、延長藥物半衰期以增加其生物利用度、降低藥物毒性等，被廣泛用作親水性藥物的載體[51]。目前脂質體納米載體主要分為固體脂質納米顆粒和納米結構脂質載體(nanostructured lipid carriers, NLC)兩類。SLN系粒徑為50～1000 nm的固體膠粒給藥系統，具有保護敏感藥物不被降解、控制藥物釋放和物理穩定性高等優點，但存在載藥能力有限、藥物會在貯存過程中泄漏等不足[52-54]。而NLC作為克服SLN缺點的一種新型膠體載體系統，由固態脂質和液態脂質混合組成，具有特殊的納米結構，從而提高了載藥量，提供了更好的包封率[6]。Khatak等[55]利用微乳技術制備了負載抗結核藥物RFP、異煙肼(isoniazid，INH)和吡嗪酰胺(pyrazinamide, PZA)的SLN。與標準抗結核藥物相比，包埋后的抗結核藥物體外抗菌效果提高約一倍。Nemati等[56]用SLN擔載乙胺丁醇(Ethambutol, EMB)，通過干粉吸入器(DPI)進行肺部直接給藥。結果表明該SLNs適合吸入給藥，而且通過四甲基偶氮唑鹽比色法(MTT法)實驗證實了該SLNs具有良好的生物相容性和安全性。同樣，Maretti等[57]制備了一種表面修飾新型甘露糖衍生物的負載RFP的固體脂質納米顆粒組件(SLNas)。研究證明與游離RFP相比，SLNas更能有效進入巨噬細胞，而且具有良好的透氣性，適合吸入給藥。在另一項研究中，Ma等[58]也設計了一種吸入性SLN (MAN-IC-SLN)，分別擔載具有甘露糖修飾作用的6-十八烷基亞氨基-1，2，3，4，5-戊醇(MAN-SA)和pH敏感的異煙肼前藥異煙酸辛叉二肼(INH-CHO),實現了靶向巨噬細胞并在細胞內的快速釋放。另外，用恥垢分枝桿菌代替結核分枝桿菌，MAN-IC-SLNs的體內外抗菌實驗效果顯著，表明該SLN可用于結核病特別是結核分枝桿菌潛伏感染的治療。Singh等[59]制備了負載硫酸鏈霉素(streptomycin sulphate，STRS)的STRS-SLN。與游離STRS相比，STRS-SLN的細胞內攝取增加了20～60倍，對H37Rv標準株顯示出更好的殺菌活性，體內外安全性也經研究得到了證實。此外，體內研究證明該制劑經口服吸收顯著，還可提高STRS的生物利用度，有助于提高患者依從性并降低治療成本，在結核病治療中有廣闊的應用前景。此外，Altamimi等[60]的研究表明，所制備的脂質體經溶血實驗驗證溶血<14%，與陰性對照相當，證明該制劑具有良好的血液相容性和安全性。因此，用脂質體納米載體裝載抗結核藥物，可明顯減少用藥頻率，提高治療效果，且具有良好的安全性。此外，脂質體也可以作為一種有效的疫苗遞送系統。Tian等[61]以DMT(一種可強力誘導免疫小鼠產生Th1型免疫應答的脂質體佐劑)為佐劑制備了一種脂質體復合物pCMFO/DMT(pCMFO，可分泌表達融合蛋白CMFO，包括4種結核分枝桿菌抗原Rv2875，Rv3044，Rv2073c和Rv0577的真核表達質粒)。結果表明，pCMFO/DMT疫苗對MTB感染可達到與BCG相當的免疫保護效果，且具有更好的安全性，可以替代活的BCG作為預防疫苗在免疫缺陷人群中應用，是一種非常有前景的結核病候選疫苗。Diogo等[62]則用磷脂酰絲氨酸包裹兩種主要結核抗原——結核分枝桿菌抗原85B(Ag85B)和早期分泌抗原靶6(ESAT-6)，制備了一種新的基于脂質體的結核病亞單位疫苗Lipo-AE。研究發現在低劑量結核分枝桿菌霧化感染的小鼠模型中，與單獨接種卡介苗的小鼠相比，再接種Lipo-AE的小鼠肺和脾中的細菌負荷顯著減少，證明Lipo-AE可以增強卡介苗對結核病小鼠的免疫和保護作用，表明脂質體是一種有吸引力的疫苗遞送系統。

由于脂質體對腸道脂肪酶敏感，而且具有良好的生物降解性和生物相容性，因此，通過靜脈內途徑給藥是安全的，并且更有利于實現脂質體的靶向治療目的。此外，還可以通過對脂質體的表面進行修飾，使其具有長循環和主動靶向的能力，從而增加藥物被靶細胞攝取的可能性，并有效降低藥物的不良反應[63]。

三、聚合物納米載體

聚合物納米載體是由天然大分子材料或合成的聚合物材料通過簡單工藝制備而成。作為使用最廣泛的藥物載體，聚合物納米載體具有藥物包封率高、穩定性好、可控制藥物釋放、保護藥物不被體液和酶破壞等優點[64]。Poh等[65]將Q203、貝達喹啉(bedaquiline，Bdq)和磁性靶向成分超順磁性氧化鐵(superparamagnetic iron oxides，SPIOs)一起包裹在可吸入的聚(D,L-丙交酯-co-乙交酯)(PDLG)載體中。體外研究結果證明該載體可以靶向至肺部，具有良好的安全性并對卡介苗有強大的殺菌效果。加上該方法操作簡便，有望成為一種新的結核病治療方案。Churilov等[66]則將新型抗結核藥物perchlozone包裹在聚乳酸微粒和納米粒中并用單鏈駱駝免疫球蛋白IgG進行修飾。結果表明無論靜脈還是腹腔注射，該制劑都可以有效輸送到肺部，提高結核病小鼠的存活率并降低感染小鼠的肺損傷程度。除了遞送抗結核藥物之外，聚合物納米載體也可用于遞送疫苗。Du等[67]將聚乳酸羥基乙酸(PLGA)和聚乙二醇(PEG)縮合后裝載結核融合蛋白M4(ESAT6-Rv2626c和Mtb10.4-HspX合并簡稱為M4)，并在其表面修飾聚肌胞苷酸poly(I:C)免疫刺激分子，構成了一種聚合物納米顆粒疫苗(簡稱NP/M4)。結果表明，NP/M4滴鼻免疫小鼠后能有效誘導小鼠細胞和體液免疫應答，有望成為結核亞單位疫苗候選納米佐劑。此外，Thomas等[68]用綠色方法合成了負載RFP的海藻酸鹽納米顆粒(RFP-ALG NPs)。對L929小鼠成纖維細胞的體外細胞毒性研究和Wistar大鼠的體內急性經口毒性實驗結果均表明該納米顆粒有良好的生物相容性。因此，基于聚合物納米載體的抗結核化療有助于減少給藥頻率和藥物劑量。從而可以降低藥物的不良反應，增加患者依從性，且具有良好的安全性。

四、明膠納米載體

明膠是一種天然的、可生物降解的多功能聚合物，通過酸或堿水解動物膠原蛋白獲得。明膠作為藥物載體被廣泛用于包封生物活性分子，具有控制藥物釋放、提高藥物療效、增加藥物穩定性等優勢。Hikmawati等[69]合成了添加鏈霉素的納米羥基磷灰石-明膠可注射骨替代物(injectable bone substitute，IBS)，研究結果表明IBS樣品在代表骨腔的羥基磷灰石支架上的注入性最高，而且對鼠腎成纖維細胞(BHK-21)和人肝細胞沒有明顯毒性，適合作為脊柱結核的候選治療方案。同樣，張賀龍等[70]制備了負載INH的殼聚糖-明膠/聚乳酸-羥基乙酸聯合載藥水凝膠。結果表明，與載藥微球相比，該凝膠可以提高抑菌率，生物相容性良好且釋藥緩慢，可以達到長期釋放抗結核藥物的目的，從而維持病灶區的有效濃度，有治療骨關節結核的潛力。但其作為藥物遞送納米載體在體內的過程比如組織分布以及降解等方面還需要進一步研究。

五、無機納米載體

無機納米載體主要是指無機材料(如碳、介孔硅、鈣、金、鐵等)構建的納米載體，具有制備簡便、易于表面修飾、載藥率高、粒徑小、尺寸可調、比表面積大、生物相容性好等優點。其中，上轉換納米顆粒(upconversion nanoparticles, UCNPs)具有多種獨特的性質，如優良的光學穩定性、近紅外光激發(較高的組織穿透能力)和生物毒性低等優點，在分子成像、疾病檢測和治療等方面都有巨大的應用潛能。近年來，UCNPs 已經被用作遞藥載體以及光動力治療劑。Li等[71]構建了新型無毒的UCNP@pyrolipid納米顆粒，評估其抗結核活性。研究中用海洋分枝桿菌(Mycobacterium marinum，M.m)代替結核分枝桿菌感染RAW264.7巨噬細胞，將UCNP@pyrolipid與被感染細胞共孵育2 h。在無光照條件下，UCNP@pyrolipid對巨噬細胞內的M.m有內在抗菌作用。而在980 nm激光照射下，UCNP@pyrolipid誘導的抗菌光動力治療(photodynamic therapy，PDT)效應增強了其對M.m的抗菌活性，表明UCNP@pyrolipid聯合光照能有效抑制巨噬細胞內M.m的生長，在結核病治療方面具有巨大潛力。而金屬納米載體由于其小尺寸、對細菌的選擇性以及一些額外的抗菌性能，也有望成為一種用于結核病治療的新型載體[72]。Ellis等[73]設計了一種含有銀(Ag)和氧化鋅(ZnO)納米顆粒的可生物降解的多金屬微粒(multi-metallic microparticles，MMP)，用于遞送RFP至肺部。體外研究結果證實了MTB感染的THP-1細胞可以有效攝取MMP，同時提高RFP的抗結核效果，表明MMP是一種可行的藥物遞送系統。此外，金屬有機框架(metal-organic frameworks, MOFs)是由金屬離子或離子簇和有機配體通過配位作用自組裝形成的具有高度規整的無限網格結構的聚合物。因其具有組成多樣、易于表面功能化、結構可調、高孔隙率、比表面積(表面積/體積的比例)大及生物相容性好等特點，在藥物控釋、氣體存儲、生物傳感和生物成像等方面具有廣闊的應用前景。Wyszogrodzka-Gawe等[74]構建了負載INH的MOF Fe-MIL-101-NH2納米顆粒，并在小鼠巨噬細胞RAW246.9上進行了細胞活力和攝取研究。結果表明該材料具有良好的空氣動力學性能，可實現INH的控制釋放，且與原始的INH-MOF相比更容易被巨噬細胞吸收。另外，與其他體內外研究一致，該MOF也具有良好的安全性[75]，表明其在個性化肺結核治療中具有一定的應用潛力。此外，還有一些無機納米材料可作為藥物遞送載體。Tenland等[76]制備了一種含有可以抑制結核分枝桿菌的新型抗菌肽NZX的介孔二氧化硅納米顆粒(mesoporous silica particles，MSP)。結果表明，NZX-MSP能被細胞特別是原代巨噬細胞攝取。另外，在感染H37Rv的原代巨噬細胞和小鼠結核病模型中，與游離NZX相比，NZX-MSP顯著促進了MTB的清除。并且在治療濃度范圍內，該MSP未對哺乳動物細胞顯示毒性，表明其生物相容性良好。Miranda等[77]則設計了一種具有磁性響應的多功能微粒系統(MPs)，用于抗結核候選藥物P3的肺部遞送。研究結果表明P3-MPs有利于肺泡沉積和肺泡巨噬細胞吞噬，而且具有pH敏感的藥物釋放特性，可以根據治療要求在預定的時間以需要的頻率釋放預定數量的藥物，有利于提高結核病的治療效率和患者的依從性。

總結與展望

目前，已有多種納米載體用于結核病的治療，如納米乳劑、脂質體納米載體、聚合物納米載體、明膠納米載體等。這些納米藥物遞送系統作為藥物載體具有獨特優勢，如保護藥物生物活性和穩定性，提高運載能力，可有口服或吸入劑型，可緩釋給藥，延長藥物作用時間，可通過提高藥物生物利用度從而提高療效，減少治療的劑量、頻率和不良反應的發生，從而更好地改善患者對結核病治療的依從性等。

然而盡管最近在基于納米技術治療結核病方面的研究取得了良好進展，商業化納米制劑的研發仍處于初級階段。一方面需要進行更多的臨床前研究和臨床研究，需要嚴格的質量控制及參數評估，如藥物的穩定性、體內的組織分布及載體的細胞毒性等，才能實現商業化應用。另一方面，轉向臨床應用時，納米遞藥載體在大規模制造、生物兼容性、安全性、總體成本效益、可重復性等方面仍存在局限性。納米技術為開發新的藥物遞送系統打開了一扇大門，為結核病的治療提供了新的途徑。為了早日實現將實驗室研究轉化為臨床實踐，需要更多有效的臨床前研究和財政支持，才能實現這一目標。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突

作者貢獻田娜：數據收集及整理、論文撰寫；褚洪遷：論文修改；孫照剛：研究指導、論文修改