基于UPLC-QTOF-MS和多元統計分析的赤芝道地性研究△

張國亮，王曉彤，王漢波，趙建霞，李振宇，4，俞飛龍，4，李振皓，*

1.浙江壽仙谷植物藥研究院有限公司，浙江 杭州 310000；2.浙江壽仙谷醫藥股份有限公司，浙江 武義 321200；3.壽仙谷珍稀藥材產品省級重點農業企業研究院，浙江 武義 321200；4.浙江省珍稀植物藥工程技術研究中心，浙江 武義 321200

靈芝為多孔菌科真菌赤芝Ganoderma lucidum（Leyss.ex Fr.）Karst.或紫芝G.sinenseZhao，Xu et Zhang 的干燥子實體，具有補氣安神、止咳平喘等功效?，F代研究表明，靈芝具有良好的抗腫瘤、免疫調節、抗氧化、降血糖等生物活性[1-3]，在臨床上有廣泛應用。靈芝酸是靈芝主要的小分子活性成分，從靈芝屬中分離出的靈芝酸類化合物已有300多個[4]。研究表明，靈芝酸類化合物不僅具有免疫調節活性[5]，而且對不同腫瘤均有較明顯的抑制作用，抗腫瘤機制包括阻滯細胞周期、誘導細胞凋亡和自噬，以及抑制轉移和血管生成等[6-7]。此外，靈芝酸還具有抗炎、抗氧化、抗菌和調血脂等活性[8]。

浙江有悠久的靈芝使用歷史，在浙江田螺山、余杭鎮南湖、湖州千金鎮塔地3 個新石器時代遺址出土的史前靈芝樣品將我國靈芝的應用歷史追溯至6800 多年前[9]。歷代著作對浙江產靈芝也多有描述[10]。由中華中醫藥學會發布的《靈芝道地藥材》確定浙江為靈芝的道地產區之一。靈芝也是浙江省確定的新“浙八味”代表性品種之一。但是，道地與非道地產區靈芝在化學成分、生物活性上的差異缺少系統研究，不同種植方式（段木、代料、野生）、采收時期等對靈芝質量的影響也尚未明確。本研究應用超高效液相色譜-四級桿飛行時間質譜法（UPLC-QTOF-MS）對不同產區、種植方式和采收時期的120 批赤芝樣品中的靈芝酸類成分進行檢測，結合多元統計分析，對赤芝的道地性進行分析，初步篩選出浙產赤芝的道地性標志物，為闡明赤芝的道地性提供數據支撐，也為赤芝優良品種選育、藥效物質篩選提供參考。

1 材料

1.1 試藥

從浙江、安徽、四川、山東、福建5 個產區收集了120 批赤芝樣品，經浙江壽仙谷醫藥股份有限公司朱衛東高級農藝師鑒定均為赤芝Ganoderma lucidum（Leyss.ex Fr.）Karst.，包括代料、段木和野生3 種種植方式，以及現蕾、開傘、成熟、采收4 個生長時期，見表1。

表1 赤芝樣品信息

對照品靈芝酸C2（批號：PS000597，純度：99.28%）、靈芝酸C1（批號：PS010882，純度：99.84%）、靈芝酸G（批號：PS010838，純度：96.76%）、靈芝烯酸B（批號：PS010839，純度：99.88%）、靈芝酸B（批號：PS010857，純度：99.41%）、靈芝烯酸A（批號：PS011374，純度：98.60%）、靈芝酸A（批號：PS010388，純度：99.89%）、赤芝酸A（批號：PS010891，純度：98.44%）、靈芝烯酸D（批號：PS010884，純度：99.51%）、靈芝酸D（批號：PS000598，純度：98.82%）、靈芝醇B（批號：PS011327，純度：98.64%）、靈芝醛A（批號：PS011330，純度：97.54%）、靈芝烯酸C（批號：PS010840，純度：99.87%）均購自成都普思生物科技股份有限公司；靈芝酸F（批號：CFS201903，純度≥98%）、靈芝酸DM（批號：CFS202001，純度≥98%）、靈芝酮三醇（批 號：CFS201903，純 度≥98%）、靈 芝 醇F（CFS201902，純度≥98%）均購自武漢普標科技有限公司；乙腈（色譜純，賽默飛世爾科技公司）；甲醇、甲酸（色譜純，美國默克公司）；水為實驗室自制超純水。

1.2 儀器

ACQUITY UPLC I-Class Plus 型超高效液相色譜儀、SYNAPT XS 型高分辨質譜儀、ACQUITY UPLC HSS T3 型色譜柱（美國Waters 公司）；XS205DU 型分析天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；Minispin 型高速離心機（德國艾本德公司）；KQ52000E型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；Direct Q5型超純水儀（德國默克密理博公司）。

2 方法

2.1 樣品制備

2.1.1 對照品溶液的制備 分別精密稱取17 個靈芝酸對照品適量，加色譜級甲醇搖勻使其充分溶解，并定容，配制成終質量濃度為0.05 mg·mL-1的單一對照品溶液。

2.1.2 供試品溶液的制備 分別精密稱取受試樣品各0.5 g，置具塞錐形瓶中，加色譜級甲醇50 mL，超聲（功率200 W，頻率40 kHz）提取30 min，冷卻，用0.22 μm 的微孔濾膜濾過，取續濾液，即得供試品溶液，待UPLC-QTOF-MS分析。

2.2 色譜與質譜條件

色譜條件：Waters ACQUITY UPLC HSS T3 色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）；流動相為0.1%甲酸水溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脫（0 min，20%B；0～2 min，20.0%～26.5%B；2～9 min，26.5%B；9～19 min，26.5%～35.0%B；19～28 min，35.0%～60.0%B；28～32 min，60.0%～70.0%B；32～37 min，70.0%～90.0%B；37～40 min，90.0%～100.0%B；40～45 min，100.0%B）；流速為0.45 mL·min-1；柱溫為25 ℃；進樣體積為1 μL。

質譜條件：ExionLC ?AC 液相系統，串聯X500R QTOF 質譜系統；電噴霧離子源，正、負離子模式；質量掃描范圍為m/z100～1500；霧化氣（Gas1）壓力為379 kPa，干燥氣（Gas2）壓力為413 kPa，氣簾氣（Cur）壓力為241 kPa，碰撞氣（CAD）壓力為48 kPa；離子源溫度為600 ℃；離子源負離子時電壓為-4500 V、正離子時電壓為4000 V。

2.3 數據處理

質譜原始數據通過SCIEX OS 1.5 進行處理，對靈芝酸進行鑒定，獲取相應的峰面積；采用SIMCA 14.1的正交偏最小二乘法-判別分析（OPLS-DA）模塊進行多元統計分析；以模型對X和Y矩陣的解釋率（R2X、R2Y）、模型的預測能力（Q2）等指標評價聚類效果，通過變量重要性投影（VIP）值（VIP＞1）和t檢驗（P＜0.05）篩選差異化合物。

3 結果與分析

3.1 赤芝化學成分鑒定

17 個對照品分別在正、負離子條件下進行質譜數據采集，并根據分析結果建立譜庫。從對照品總離子流圖看，靈芝酮三醇、靈芝醇F、靈芝醇B、靈芝醛A 在正、負離子條件下均未出峰，且以準分子離子或加酸峰離子等也未提取到目標峰，推測這些成分在現有分析條件下響應不佳，可能與電離模式有較大關系。其余13 個靈芝酸類化合物響應高、分離度好且峰形良好，適用于定性定量分析。13 個對照品、樣品的質譜信息見表2，總離子流圖見圖1。

圖1 赤芝樣品與對照品總離子流圖

表2 赤芝中靈芝酸類化合物質譜信息

3.2 基于層次聚類的赤芝道地性分析

結合對照品的二級質譜圖，從赤芝中鑒定了13 個靈芝酸類成分。根據這些成分在不同赤芝樣品中的相對含量，應用ward.D2 算法進行層次聚類分析（圖2）。如圖2A所示，盡管多數同產區的赤芝可以聚為一類，但仍有不少樣品未能較好的聚類。這主要是因為檢測的赤芝樣品在種植方式和采收時期上存在較大差異，這些差異使得靈芝酸的含量發生變化，導致層次聚類法不能很好地將浙產和非浙產赤芝區分。

進一步分析發現，編號為7～9、19～21、25～30的樣品中靈芝烯酸C、靈芝酸C2、靈芝酸A、靈芝酸DM、靈芝烯酸B、靈芝酸B、靈芝酸G、靈芝酸C1的相對含量普遍高于其他樣品。編號為85～93、97～111 的樣品中靈芝酸B、靈芝酸G、靈芝酸C1、靈芝酸F、靈芝酸D、靈芝烯酸D的相對含量普遍高于其他樣品。此外，通過對樣品中各靈芝酸的相關性進行分析（圖2B），發現多數靈芝酸呈現較好的正相關。關，其中靈芝酸C1和靈芝酸F，靈芝酸C2和靈芝烯酸C，靈芝酸B 和靈芝酸G 等的相關性較強，可能因為這些成分的生物合成途徑較為接近，為靈芝酸的生物合成調控研究提供了參考。

圖2 基于層次聚類的赤芝道地性分析

3.3 基于多元統計分析的赤芝道地性分析

根據產地信息，將樣品分為浙產和非浙產2 個組別，通過OPLS-DA 模型對兩組進行差異成分分析（圖3）。模型的R2X=0.866，R2Y=0.903，Q2=0.883，說明該模型擬合及預測能力良好。如圖3A所示，浙產與非浙產赤芝樣品可在得分圖中明顯聚為2 類，說明兩者間的化學成分存在明顯差異。通過VIP 值對差異靈芝酸進行篩選，以VIP 值＞1 為限值，篩選出靈芝酸D、靈芝烯酸B、靈芝烯酸D 等差異成分，表明這些成分對聚類有較大貢獻（圖3B）。其中靈芝酸D、靈芝烯酸D 在浙產赤芝樣品中顯著高于非浙產赤芝（圖3C～D），可以作為浙產赤芝的標志性成分。對浙產與非浙產赤芝樣品中靈芝酸D、靈芝烯酸B、靈芝烯酸D 含量進行t檢驗，差異均有統計學意義（P＜0.001，圖4）。

圖3 基于OPLS-DA的浙產和非浙產赤芝差異性分析

圖4 浙產與非浙產赤芝差異性成分

3.4 浙產與非浙產段木赤芝差異性分析

不同產地赤芝的種植方式存在較大差異，如浙江赤芝以段木栽培為主，山東以代料栽培為主，安徽2 種模式都有應用。本研究收集了21 份非浙產段木赤芝和51 份浙產段木赤芝，為減少不同因素對聚類造成的差異，進一步用OPLS-DA 分析了浙產與非浙產段木赤芝的差異成分（圖5）。模型的R2X=0.939，R2Y=0.932，Q2=0.918，說明該模型擬合及預測能力良好。

如圖5A 所示，浙產與非浙產段木赤芝樣品可明顯聚為2 類，說明兩者間的成分存在明顯差異。VIP值＞1 的化合物有4 個（圖5B），對其進行t檢驗，4 個成分在2 組樣品中含量顯著有統計學意義（P＜0.001，圖6），且浙產段木赤芝樣品中靈芝酸D、靈芝酸B、靈芝酸C1、靈芝酸G的含量均高于非浙產段木赤芝。這可能與各產地的環境氣候有較大關系，浙江的環境氣候有利于靈芝酸D等4個靈芝酸的積累。

圖5 基于OPLS-DA的浙產與非浙產段木赤芝差異性分析

圖6 浙產與非浙產段木赤芝差異性成分

3.5 浙產段木與野生赤芝差異性分析

選取采收期的27份浙產段木赤芝及12份浙產野生赤芝，通過OPLS-DA 模型對2 組進行差異性分析，比較人工栽種赤芝與野生赤芝的質量差異（圖7）。模型的R2X=0.983，R2Y=0.952，Q2=0.917，說明該模型擬合及預測能力良好。如圖7A所示，浙產段木赤芝與野生赤芝可明顯聚為2 類，說明兩者間的成分存在明顯差異。野生赤芝的組內差異較大，而段木赤芝的組內差異較小，也說明人工種植有利于確保藥材的質量一致性。VIP 值＞1 的化合物有5 個（圖7B），對其進行t檢驗，差異有統計學意義（P＜0.001，圖8），且段木赤芝中靈芝烯酸D、靈芝烯酸B、靈芝烯酸A、靈芝烯酸C、靈芝酸A 5 個成分相對含量均高于野生赤芝。

圖7 基于OPLS-DA的浙產段木與野生赤芝差異性分析

圖8 浙產段木與野生赤芝差異性成分

3.6 不同發育時期赤芝差異性分析

通過OPLS-DA 模型對武義產區現蕾期、開傘期、成熟期和采收期4 個發育階段共36 份赤芝樣品進行聚類分析。模型的R2X=0.990，R2Y=0.865，Q2=0.785，說明該模型擬合及預測能力良好。如圖9A所示，不同發育時期赤芝樣品聚類效果明顯，說明成分存在明顯差異。VIP 值＞1 的化合物有3 個（圖9B），分別是靈芝酸DM（圖9C）、靈芝烯酸B（圖9D）和靈芝烯酸C，表明這些成分對聚類貢獻較大，是主要的差異成分。用平行坐標圖直觀展示不同發育時期靈芝酸含量的差異（圖10），可發現現蕾期樣品靈芝酸含量相對較高，隨著子實體逐漸成熟，多數靈芝酸含量有下降的趨勢。

圖9 基于OPLS-DA的不同發育時期赤芝差異性分析

圖10 赤芝不同發育時期靈芝酸相對含量變化

4 討論

我國靈芝種類達100 多種，分布最廣地區在南嶺南北，包括廣東、廣西、福建、臺灣南部、海南、香港，以及云南西雙版納、西藏的察隅和墨脫及林芝地區。由于各產區生態環境差異，靈芝品種數量及優勢菌株差異較大[11]。吳鴻雪等[12]對不同品種、不同基質、不同生長時期的靈芝子實體的總靈芝酸含量、單體靈芝酸含量及抑制腫瘤細胞增殖活性進行了測定，發現不同樣品單個靈芝酸含量變化較大，但總靈芝酸含量差異較小，體外抗腫瘤作用也相近。金鑫等[13]對不同生長期靈芝的農藝性狀和多糖含量進行了研究，發現成熟期多糖含量達到最高值。郭曉蕾等[14]應用高效液相色譜法（HPLC）指紋圖譜評價了不同產地靈芝樣品的相似性，發現除個別樣品外，各產地樣品與對照指紋圖譜的相似度都較高。本研究結果表明，不同產區、不同栽培條件、不同生長時期赤芝的化學成分存在較明顯差異。

液相色譜與質譜聯用技術是一種集高效分離與高靈敏度、高選擇性檢測于一體的現代分離分析技術，可同時測定數十個甚至上百個成分，近年來在中藥化學分析中得到了廣泛運用[15-16]。在本研究中，利用UPLC-QTOF-MS 同時檢測了赤芝中13 種靈芝酸類成分，并對不同產地、不同栽培方式、不同發育時期的樣品進行分析，可以更全面地評價赤芝的道地性。

通過綜合運用UPLC-QTOF-MS和多元統計分析發現，不同產地赤芝樣品在化學成分上有較為明顯的差異。靈芝酸D、靈芝烯酸D 在浙產赤芝樣品中顯著高于非浙產赤芝，說明浙江的氣候環境容易使這2 個成分在赤芝中蓄積，可作為浙產赤芝的標志性成分。進一步對浙產和非浙產段木赤芝進行分析，發現靈芝酸D、靈芝酸B、靈芝酸C1、靈芝酸G 4個成分含量均顯著高于非浙產段木赤芝，其中靈芝酸D提高了近8 倍。靈芝酸D 可以通過激活蛋白激酶R樣內質網激酶（PERK）核轉錄因子E2相關因子2（Nrf2）通路發揮抗衰老作用[17]，也具有較好的抑制腫瘤細胞增殖等作用[18]。靈芝烯酸D 為潛在的抗腫瘤活性成分[19]。靈芝酸B 對脂多糖誘導的急性肺損傷有良好的保護作用[20]，可通過逆轉ATP 結合蛋白亞家族1 抗體（ABCB1）介導的多藥耐藥來恢復化療藥物對腫瘤細胞的細胞毒作用[21]，對人類免疫缺陷病毒-1（HIV-1）蛋白酶有明顯的抑制作用[22]。靈芝酸C1則表現出很好的抗炎作用[23]。上述研究結果也提示，靈芝酸含量的改變可能導致赤芝相應的生物活性發生變化，可進一步應用報道的模型比較研究浙產和非浙產赤芝在生物活性上的差異。

野生藥材與人工栽培藥材孰優孰劣，一直存在不同的看法。本研究也對浙產段木和野生赤芝的差異進行了研究，發現人工栽培的段木赤芝中靈芝烯酸D、靈芝酸A 等成分均顯著高于野生赤芝。此外，不同批的段木赤芝也表現出較好的穩定性，這有助于確保臨床療效的一致性。靈芝酸A 具有抗腫瘤、抗炎、抗氧化、恢復肝損傷、抗關節炎等多種藥理活性，是具有開發前景的候選藥物[24-27]。后續應結合體內、體外藥效學實驗，進一步評價野生與人工栽培赤芝活性的差別。

本研究也發現，不同發育時期赤芝樣品中，靈芝酸含量有較大差異。總體而言，現蕾期樣品中靈芝酸含量較高，開傘期次之，成熟期和采摘期相對較低，與文獻[28]報道較為一致。通常認為產孢赤芝在噴孢子粉后（采摘期），靈芝酸等活性成分會呈現下降趨勢。本研究也發現，有些品種成熟期和采摘期靈芝酸的含量差異較大，一些品種在噴粉后，靈芝酸含量并沒有顯著下降。從綜合利用角度考慮，這些品種既可提供孢子粉原料，也可作為赤芝子實體（飲片）原料，且不損失活性，有較大的開發價值。下一步計劃檢測噴粉前后生物活性的變化，并從分子育種角度，對其種質進行評價，選育出高活性的新赤芝品種。

本研究較為全面地對赤芝的道地性進行了評價，初步篩選出具有特征性的浙產赤芝化學標志物。有研究表明，地理和氣候等因素所致的土壤環境異質性，以及內生菌、微生物等微生態的因素對道地性有重要影響[29-30]。因此，后續研究也可以對不同產地的土壤及其微生態進行分析，結合遺傳因素等及人工智能、神經網絡等先進算法，更全面地闡明赤芝道地性形成機制。也需要結合不同層次的藥效學實驗進行闡釋和驗證，并結合臨床研究，為道地藥材的療效優越性提供數據支撐。