基于ITS2一級序列和二級結構對土茯苓及混偽品的鑒別研究△

鄭夢迪，賀紫涵，張寒，張彥

西安醫學院，陜西 西安 710021

土茯苓為百合科植物光葉菝葜Smilax glabraRoxb.的干燥根莖，味甘、淡，性平，具有除濕、解毒、通利關節的功能，在臨床中有較高的藥用價值[1]。現代藥理研究表明，土茯苓具有免疫調節、抗腫瘤、緩解動脈粥樣硬化、護肝、止咳祛痰、抗炎、鎮痛等作用，為其藥品、保健食品的開發提供了思路[2]。但作為一種常用中藥，在采收、加工、使用過程中土茯苓不同品種混雜問題嚴重，且文獻記載不嚴謹、外觀表型相似和地方用藥習慣等原因導致菝葜屬、肖菝葜屬及其他科屬多種植物也被當做土茯苓使用[2-3]。這些混淆品大致分為兩類，一類是以同屬（菝葜屬）植物黑果菝葜S.glaucochinaWarb.為主的“紅土茯苓”，即地方俗稱的“菝葜”；另一類是以百合科肖菝葜屬植物肖菝葜Heterosmilax japonicaKunth 為主的“白土茯苓”，即俗稱“土萆薢”。自古以來，四川和云南等地就有“土茯苓”“萆薢”“菝葜”混稱和混用的習慣。目前，各地中藥市場上土茯苓的混淆品較多，除主要混淆品菝葜、肖菝葜以外，還有菝葜屬和肖菝葜屬的多種植物，如馬甲菝葜、長托菝葜、小果菝葜、合絲肖菝葜等也被當做土茯苓使用[4-5]。這種摻雜混淆品的現象，在一定程度上造成了土茯苓藥材來源的品種混亂和質量良莠不齊，給土茯苓臨床用藥安全帶來隱患。傳統的中藥材鑒別手段要求鑒定人員具有較高的植物分類專業知識和技能，這使中藥材基原的準確鑒別具有一定局限性。因此，需要一種更科學、準確和穩定的方法作為補充鑒別方法。

本研究采用近年來迅速發展的DNA 條形碼技術，可直接從基因水平上提供豐富的鑒別依據。此前，已有學者采用psbA-trnH序列對土茯苓的基原植物及其近緣種進行鑒定，然而出現了部分物種種內、種間無法識別的現象，matK、rbcL序列的變異位點也較少[6-7]。內轉錄間隔區2（internal transcribed spacer 2，ITS2）序列位于5.8 S和28 S rDNA 基因之間，具有長度短、易擴增的特點，適用于植物屬、種的鑒定[8]，是目前植物分類研究和藥用植物鑒定常用的分子標記之一[9-10]。在植物細胞中，ITS2 rDNA的二級結構是由一級序列自身回折而形成部分堿基配對和單鏈交替出現的莖環結構，真核生物ITS2 二級結構為高度保守的“一環四臂”模型[11]。ITS2 二級結構不僅包含系統發育信息，還可以補充和修正由于旁系同源或假基因所導致的系統發育樹構建誤差[12]。目前，關于土茯苓及其混偽品的鑒定研究尚無結合ITS2 核酸序列信息及其二級結構信息進行親緣關系鑒定方面的研究[13]。因此，本研究建立更加成熟和標準的土茯苓DNA 條形碼鑒定方法，為其DNA條形碼的選擇提供參考。

1 材料

本研究選取了土茯苓及常見混偽品的ITS2 序列作為實驗研究對象，從GenBank 數據庫下載土茯苓正品來源光葉菝葜S.glabraRoxb.序列5 條、混偽品菝葜屬黑果菝葜S.glaucochinaWarb.序列4條、長托菝葜S.feroxWall.ex Kunth 序列3 條、馬甲菝葜S.lanceifoliaRoxb.ex A.DC.序列3 條、小果菝葜S.davidianaA.DC.序列4 條和圓錐菝葜S.bracteataC.Presl 序列3 條；以及來自肖菝葜屬的混淆品種肖菝葜H.chinensis（Kunth）A.DC.序列3 條、合絲肖菝葜H.japonicaKunth var.gaudichaudiana（Kunth）Wang et Tang 序列3 條和短柱肖菝葜H.yunnanensisGagnep.序列3 條。GenBank樣本序列號及其對應物種信息見表1。

表1 GenBank土茯苓及其混偽品序列號及其對應物種信息

2 方法

2.1 ITS2序列的獲取、注釋及二級結構預測

在GenBank（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）中選擇Nucleotide 數據庫，下載正品土茯苓及其混淆物種的ITS2 序列，再采用Blast 功能和序列注釋信息剔除可疑序列。基于隱馬爾可夫模型（HMM）[14]在ITS2 Database[15]中注釋下載的每一條ITS 序列，去除兩端5.8 S 和28 S 區域，得到經注釋后完整的ITS2序列，再利用ITS2數據庫對各樣本進行ITS2二級結構的預測。

2.2 傳距離及聚類分析

使用MEGA 7.0軟件[16]統計30個樣本ITS2序列的堿基含量，利用在線網站clustal omega（https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/）對收集到的30 個樣本進行同源對比，最終統計得出變異位點；基于Kimura-2-Parameter（K2P）模型進行遺傳距離的計算，鄰接法（neighbor-joining，NJ）構建系統發育樹，設置bootstrap 分析1000 次重復以檢測分支的可靠性。

2.3 ITS2一級序列聯合二級結構構建系統發育樹

通過ITS2 Database 下載各樣本的一級和二級結構聯合后的矩陣，將所有樣本矩陣導入4Sale 1.7.1軟件[17]進行比對。比對完成后構建ITS2 一級結構和二級結構系統發育樹，比對好的結果導入ProfDistS軟件[18]中，基于距離法構建剖面鄰接（profile neighbor joining，PNJ）系統發育樹，同樣設置bootstrap 自展分析1000 次來檢驗系統發育樹分支關系的可靠性。

3 結果

3.1 ITS2序列特征及差異性分析

對土茯苓及其混偽品進行ITS2 序列分析，如表2 所示，正品土茯苓光葉菝葜的序列長度平均值為245 bp，G+C 占比為82.70%；菝葜屬混偽品黑果菝葜、長托菝葜、馬甲菝葜、小果菝葜及圓錐菝葜ITS2平均序列長度為247、245、242、244、243 bp、G+C 占比為81.00%、78.40%、79.80%、81.00%、81.20%；肖菝葜屬肖菝葜、合絲肖菝葜、短柱肖菝葜ITS2 平均序列長度分別為249、247、248 bp，G+C 占比分別為82.00%、81.60%、82.20%。土茯苓與各混偽品的變異位點數目和位置均存在差異（表3）。正品土茯苓（光葉菝葜）種內變異位點僅存在于222 位，共有2 種單倍型（A1 和A2），A1 包括4 條序列，堿基為A，占比80%；A2 包括1 條序列，堿基為C，占比20%。

表2 土茯苓及其混偽品序列特征

表3 土茯苓及其混偽品ITS2序列變異位點

3.2 遺傳距離分析

基于K2P 模型在MEGA 7 中計算遺傳距離。如表4 所示，土茯苓及各個混偽品的種內遺傳距離均為0；而各種間遺傳距離為0.008～0.059。其中，種間最小遺傳距離為土茯苓和短柱肖菝葜0.008，種間最大遺傳距離為長托菝葜和合絲肖菝葜0.059。土茯苓與其混偽品黑果菝葜的遺傳距離為0.021，與土茯苓遺傳距離最大的品種為長托菝葜0.044。

表4 土茯苓及其混偽品遺傳距離

3.3 ITS2二級結構預測及分析

本實驗利用ITS2 一級序列和二級序列聯合矩陣，導入4Sale 1.7.1 軟件中，得到土茯苓及其混偽品的二級結構。如圖1 所示，二級結構為典型的“一環四臂”結構，臂Ⅲ為最長臂，其余臂長長度近似，但臂Ⅱ的結構最為保守，臂Ⅳ上有較大變異，中間的主環也較為保守，符合《中華人民共和國藥典》（以下簡稱《中國藥典》）2020 年版規定的真核生物二級結構模型。對比各二級結構的臂Ⅰ，土茯苓有1個發夾環和1個內環，混偽品中的圓錐菝葜含2 個內環；在臂Ⅱ上，除短柱肖菝葜無嘧啶-嘧啶錯配的內環外，土茯苓與其余混偽品均包含1 個內環。然而，在臂Ⅲ和臂Ⅳ中土茯苓與其他混偽品的區別最大。在臂Ⅲ上，從各內環的大小上看，馬甲菝葜的嘧啶-嘧啶錯配環明顯大于土茯苓及其他混偽品；從內環數目上來看，短柱肖菝葜臂內環數最多有7個，圓錐菝葜和黑果菝葜的內環數較少，含4個內環；且圓錐菝葜和黑果菝葜的內環位置也與其他物種有明顯差異。在臂Ⅳ中，長托菝葜較其他品種多一個內環；臂Ⅳ上突環的大小也有較大差異，如長托菝葜、肖菝葜、長托肖菝葜、合絲肖菝葜明顯大于土茯苓及其他混偽品。綜上所述，土茯苓與其最常見的混偽品黑果菝葜、肖菝葜在臂Ⅲ、臂Ⅳ有較明顯的特征，如黑果菝葜臂Ⅲ較土茯苓和肖菝葜多1 個內環；肖菝葜在臂Ⅳ上的突出單鏈較土茯苓和黑果菝葜長。

圖1 土茯苓及其混偽品的二級結構

3.4 NJ進化樹和PNJ聚類樹的系統發育分析

本研究利用ITS2 序列和一級序列及二級結構聯合矩陣分析，分別構建了土茯苓與其混偽品的NJ系統發育樹和PNJ系統發育樹（圖2）。在構建的NJ系統發育樹中結果顯示，土茯苓與黑果菝葜、肖菝葜及其他混偽品均分別聚類，不同物種各自聚為一支，且自展支持率均在60%以上的支系有9 個、80%以上的有6個、90%以上的有4個，說明不同混偽品與土茯苓的親緣關系較遠。另外，PNJ 系統發育樹也表明了相同的分支情況，且分支更多，顯示出更多的遺傳信息，具有較好的單系性，在自展支持率上也有所提高。2 種系統發育樹的結果均說明ITS2 序列適用于土茯苓及其混偽品或近緣種的鑒別。

圖2 土茯苓及其混偽品的NJ系統發育樹及PNJ系統發育樹

4 討論

ITS2 是《中國藥典》2020 年版規定可用于植物物種鑒定的一種核心條形碼，也是系統發育分析最常用的基因之一，ITS2 序列較短，相比ITS 有著更高的聚合酶鏈式反應（PCR）擴增成功率[19]。陳士林等[20]建議將ITS2序列作為藥用植物的核心DNA條形碼。《中國藥典》2010、2015 年版已收錄基于ITS2 序列鑒定藥用植物的方法，并且在藥用植物的分類鑒別中取得初步進展。然而，單獨將ITS2 一級序列作為分子標記仍有一定局限性。首先，ITS2 不能滿足所有科屬植物的鑒別，如在杜鵑屬中的鑒別效率僅為21.9%[21]；其次，ITS2 序列變異速度快，更適用于屬以下級別物種的鑒別[22]。而ITS2 二級結構為不同物種的比對分類提供了一級序列未包含的更多信息。ITS2 二級結構有保守性結構“一環四臂”，因其“一環四臂”的結構有助于指導一級核酸序列的排列，對于一級核酸序列起到校正的作用[11-12]。

本研究通過對土茯苓及其混偽品ITS2 序列分析，搜集到的土茯苓ITS2 序列種內在222 bp 位點有1 個變異位點，保守性高、穩定性好；同時，遺傳距離結果表明，土茯苓種內遺傳距離為0，遠小于土茯苓與其他混偽品的種間最小遺傳距離0.008，符合“種間遺傳距離符合10 倍以上”的種內遺傳原則；聯合一、二級結構共同構建的PNJ 系統發育樹分析，得到與一級結構NJ系統發育樹相對應的分支情況，同時使得系統發育樹分支變多，提高了個別物種的自展支持率，PNJ 系統發育樹對NJ 系統發育樹起到了修正優化作用，即土茯苓可與其混偽品區分開；同時，正品土茯苓與混偽品的二級結構在各臂上環的數量、大小等存在較大的差異，二級結構的差異可以作為一種額外的信息指導土茯苓及其混偽品的鑒別。建議ITS2 可以作為鑒別土茯苓及其混偽品的DNA 條形碼。本研究為藥用正品土茯苓及其混偽品的準確鑒定提供了參考。