基于細胞類型特異性網絡的雷公藤治療類風濕性關節炎作用機制解析△

任興德，紀徐維晟，劉淑明，王耘*

1.北京中醫藥大學 生命科學學院，北京 102488；2.北京中醫藥大學 中藥信息工程中心，北京 102488

類風濕性關節炎（RA）是一種慢性自身免疫性疾病，以滑膜關節的結締組織炎癥為主要癥狀，當前全世界有2200 萬～7600 萬人患有該疾病[1]。RA 可致患者行動不便，病情嚴重時會致殘。RA的發病機制十分復雜，目前仍未明確，一般認為是由感染和炎癥因子引發。當前針對RA 的治療暫無特效藥，臨床上主要使用的化學藥有非甾體抗炎藥、糖皮質激素、生物制劑等，但這些藥物長期使用通常有較為嚴重的不良反應[2]。中醫認為RA 屬于痹癥范疇，邪氣痹阻經脈為其病機，臨床上治療以祛風除濕、活血通絡為主[3]。相比于化學藥治療，中藥治療具有療效顯著且不良反應少的優勢[4]。雷公藤是中醫治療RA 的常用藥，研究表明雷公藤對于RA 有良好的治療效果[5]，但是其作用機制尚不明確，這限制了雷公藤在醫學實踐中的應用。

由于中藥多成分、多靶點的特性，導致其作用機制難以明確，嚴重制約了中醫藥的發展。為了解決該問題，目前學界進行了大量的研究，包括中藥藥理學、中藥化學、分子生物學、網絡藥理學等[6]。由于傳統的實驗研究周期長、人力物力消耗大，因此近年來網絡藥理學備受關注[7]。網絡藥理學基于疾病-基因-靶點-藥物相互作用網絡，從多途徑、多靶點角度系統研究中藥的作用機制[8]。這種研究方法的整體性、系統性特點與中醫藥治療的特點相契合，為科研人員提供了一種利用生物信息學數據研究中藥的手段。但是，當前網絡藥理學解析中藥作用機制時比較依賴于富集分析，富集分析是一種尋找目標基因集合的共同功能或通路的生物信息學方法[9]。利用該方法可以獲得中藥所作用的通路數據，但是其詳細作用機制卻難以被闡明；且富集分析所使用的背景數據是一種通用型數據，難以描述中藥在特定類型細胞中的作用機制。另外，網絡藥理學多是通過中藥-化學成分-藥物與疾病交集靶點及蛋白質-蛋白質相互作用（PPI）關系而構建的網絡，對于除PPI網絡以外的生物網絡利用較少，這在一定程度上限制了其發展。

細胞類型特異性網絡是一種以某類細胞特異性表達的蛋白質和產生的分子所參與的反應為基礎而構建的生化反應網絡，能夠將細胞內的基因、蛋白質、小分子、復合物和信號分子數據進行有效整合，更加準確地模擬細胞的生物學功能[10]，其側重點與網絡藥理學有所不同。細胞類型特異性網絡是網絡藥理學的進一步發展，其更關注的是特定細胞內的真實生物網絡。目前已經有不少基于該理論開展的研究，如重建肝細胞代謝網絡用以研究肝細胞的肝酶缺陷癥[11]、使用腎臟代謝模型預測藥物的脫靶效應[12]等。盡管細胞類型特異性網絡已經有了初步的發展，但是基于該理論進行中藥的作用機制解析研究相對較少。因此，本研究通過細胞類型特異性網絡研究雷公藤治療RA 的作用機制，以期更系統、全面地解析雷公藤的作用機制。

1 數據來源與方法

1.1 雷公藤化學成分及靶點篩選

通過中藥系統藥理學數據庫與分析平臺（TCMSP，http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）收集雷公藤的化學成分[13]。以口服生物利用度（OB）≥30%和類藥性（DL）≥0.18 對所獲得的化學成分進行篩選，將篩選結果作為雷公藤的有效成分。通過Similarity Ensemble Approach 數據庫（SEA，https://sea.bkslab.org/）[14]檢索雷公藤有效成分的靶點，將所得結果以MaxTC＞0.7（MaxTC代表化學結構相似性系數，越接近于1，所得結果的可靠性越高）為條件進行篩選。

1.2 RA疾病相關靶點篩選

以“rheumatoid arthritis”為關鍵詞，通過TTD數據庫（http://db.idrblab.net/ttd/）檢索RA 相關靶點[15]，為了保證靶點數據的有效性，只保留了標注為“Successful”的疾病相關靶點。

1.3 生化反應數據

Reactome 數據庫（https://reactome.org）是一個同行審閱、人工策展的關于人體內各項反應及生物學通路的數據庫，包含轉錄調控數據、PPI數據、信號通路數據、小分子代謝數據[16]。從該數據庫下載所有的生物學通路數據用于背景網絡的構建，數據覆蓋人類12 929個蛋白質、13 210個復合物、13 534 個生化反應、2477個通路。

1.4 不同細胞類型的基因表達數據

Fantom 數據庫（https://fantom.gsc.riken.jp/5）提供了人體不同類型原代細胞的基因表達譜數據。從該數據庫中提取B 淋巴細胞的特異性基因表達數據用于背景網絡的剪切。

1.5 細胞類型特異性網絡構建

B 淋巴細胞是一類重要的免疫細胞，與RA 的發病關系密切[17]，因此本研究基于該細胞的基因表達數據構建B 淋巴細胞的細胞類型特異性網絡。蛋白質是細胞行使生物學功能的主要物質，整合某一類細胞內的蛋白質所參與的生化反應即可得到該類細胞的細胞類型特異性網絡[18]。首先利用生物學數據構建背景網絡，然后根據一類細胞的蛋白質表達數據，剪切掉與表達量為0 的蛋白質相關的反應。若某種蛋白質的表達量為0，則將其參與的反應節點及自身節點從反應網絡中剪切掉；若該蛋白質是反應的生成物，則相應的反應節點和自身節點也需要剪切掉。按照上述規則即可得到相應細胞的細胞類型特異性網絡。

1.6 基于實體語法系統（EGS）推理雷公藤治療RA的作用機制

EGS[19]是為生物復雜系統建模而提出的一種形式語法系統，源于Chomsky 生成語法系統，是對Chomsky 生成語法系統的進一步拓展。EGS 由5 元組G=（VN，VT，F，P，S）組成。VN表示非末端字符集；VT表示末端字符集，VN∩VT=Φ；F 表示EGS中元素之間的基本關系集；P 表示推理規則集，是EGS 用于演繹的基本規則；S 是利用EGS 進行推導和證明時的初始狀態集。EGS 在中醫藥研究中已經得到了廣泛的應用[20-21]。

本研究利用EGS 構建B 淋巴細胞的細胞類型特異性網絡形式化模型，進行雷公藤治療RA 的作用機制的推理。首先用EGS 融合Reactome 當中的所有人體生化反應數據，得到人體的生化反應網絡；隨后依據Fantom 數據庫中的B 淋巴細胞基因表達數據對生化反應網絡進行剪切，得到B 淋巴細胞類型特異性網絡；最后以雷公藤藥物靶點為起點，以RA疾病靶點為終點，繪制雷公藤藥物靶點到RA 疾病靶點的網絡路徑圖，并基于此網絡分析雷公藤的作用機制。

2 結果與討論

2.1 雷公藤化學成分及靶點

通過TCMSP 收集雷公藤的化學成分144 個。以OB≥30%和DL≥0.18對所獲得的化學成分進行篩選，得到雷公藤的有效成分51個。通過SEA 數據庫檢索并篩選得到雷公藤有效成分與靶點得對應數據，見表1。

表1 雷公藤化學成分及靶點

2.2 RA疾病相關靶點

以“rheumatoid arthritis”為關鍵詞，通過TTD數據庫檢索RA 相關靶點，得到標注為“Successful”的RA 相關靶點66 個，包括酪氨酸-蛋白激酶JAK2、腫瘤壞死因子（TNF）、3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶（HMGCR）、二羥基二苯二酸脫氫酶（DHODH）、B 淋巴細胞抗原CD19、白細胞介素-6受體（IL6R）、白細胞介素-6（IL-6）、酪氨酸-蛋白激酶BTK、血管內皮生長因子A（VEGFA）、基質金屬蛋白酶1（MMP1）等。

2.3 B淋巴細胞的細胞類型特異性網絡

所得到的B 淋巴細胞類型特異性網絡共有節點36 962 個，邊66 177 條，其中包含反應10 153 個、復合物10 686個、蛋白質11 239個、小分子2733個、DNA 568個、RNA 249個、其他分子1324個（圖1）。該網絡只包含了與B 淋巴細胞表達蛋白相關的反應，能夠更加準確地模擬B 淋巴細胞的生物學功能，將作為背景網絡用于雷公藤作用機制的定性推理。

圖1 B淋巴細胞的細胞類型特異性網絡

2.4 雷公藤有效成分作用靶點與RA 疾病相關靶點的作用機制網絡

基于B 淋巴細胞的細胞類型特異性網絡，利用實體語法系統推導得到雷公藤有效成分作用于B 淋巴細胞后的生物學效應網絡（圖2），共有節點247個、邊296 條。節點大小與節點的度值成正比，其在一定程度上反映了節點在網絡中的重要性。由圖2 可以看出，雷公藤通過多成分、多靶點、多途徑起到了調節RA 的作用。雷公藤中常春藤素、威爾福萊德A、雷公藤紅素、異黃酮醇、β-谷甾醇、白樺脂酸、山柰酚、雷公藤甲素、諾比列汀9 個有效成分通過雌激素受體β（ESR2）、雌激素受體α（ESR1）、酪氨酸蛋白磷酸酶非受體1 型（PTPN1）、核受體亞家族1 H 組成員2（NR1H2）、類泛素蛋白修飾分子（SUMO）激活酶亞基2（UBA2）、SAE1、DNA 拓撲異構酶2α（TOP2A）、雄激素受體（AR）、NR1H3、CC 趨化因子受體4 型（CCR4）、多藥耐藥相關蛋白1（ABCC1）、G 蛋白偶聯膽汁酸受體1（GPBAR1）、核受體ROR-γ（RORC）前列腺素G/H合酶2（PTGS2）、腺苷三磷酸結合盒轉運體G2（ABCG2）、轉錄因子p65（RELA）、醛酮還原酶家族1 員B1（AKR1B1）、多不飽和脂肪酸5-脂氧合酶（ALOX5）18 個靶點，作用于T 淋巴細胞活化抗原CD80、CD86、CD19、酪氨酸蛋白激酶（SYK）、核受體亞家族3 C 組成員1（NR3C1）、過氧化物酶體增殖物激活受體α（PPARA）、酪氨酸蛋白激酶（BTK）、JAK1、β-干擾素（IFNB1）、JAK2、CCR5、C5、大麻素受體2（CNR2）、1-磷酸鞘氨醇受體1（S1PR1）、IL-6、雌激素相關受體α（ESRRA）、PTGS2、ABCG2、RELA、AKR1B1、多不飽和ALOX521個RA的疾病相關靶點，進而起到了治療作用。其中PTGS2、ABCG2、RELA、AKR1B1、ALOX5 既是雷公藤的直接作用靶點，也是RA 的疾病相關靶點。

圖2 雷公藤有效成分作用靶點與RA疾病相關靶點的作用機制

雷公藤治療RA 的機制主要為以下幾個方面：1）多個成分作用于1 個蛋白質，通過這個蛋白質影響多個RA 相關的疾病靶點。例如，白樺脂酸和威爾福萊德A 都能作用于PTPN1，PTPN1 參與下游反應后影響到了JAK1、JAK2、SYK、IFNB1 4 個疾病靶點所在的通路。PTPN1 可以介導多種蛋白激酶的去磷酸化過程[22]，起到調節信號強度的作用。JAK1、JAK2 都屬于JAK 家族，屬于非受體類的酪氨酸激酶，在JAK-信號轉導和轉錄激活因子（STAT）通路中介導信號傳遞[23]，該通路是免疫系統中的重要通路。SYK 也是1種非受體酪氨酸激酶，是B 細胞受體（BCR）信號通路中的關鍵激酶，也是其他免疫受體如Fc 受體和黏附受體信號轉導的關鍵組成部分，主要在B 淋巴細胞中表達[24]。IFNB1具有抗病毒作用，可通過JAK-STAT 通路進行免疫調節[25]。不難看出，JAK1、JAK2、SYK、IFNB1 都與胞外信號傳遞有關，參與了免疫細胞的功能調節。2）多個成分作用于與疾病靶點同屬于同一家族的蛋白質。例如，常春藤素、β-谷甾醇、雷公藤紅素、異黃酮醇等多個成分作用于RORC、NR1H2、NR1H3、ESR1、ESR2、AR 6 個蛋白質，這6 個蛋白質與疾病靶點NR3C1、ESRRA、PPARA 同屬于核受體家族。核受體是配體激活的轉錄因子，在細胞的分化/發育、增殖和代謝過程中發揮不同作用，且與多種病癥有關，如癌癥、心血管疾病、炎癥及生殖異常[26]。目前已有多款藥物通過靶向該家族中的NR3C1、ESRRA、PPARA 治療RA[27]。3）通過影響SUMO 結合酶UBE2I 的生成調節轉錄因子活性。雷公藤紅素、異黃酮醇、常春藤素、β-谷甾醇通過作用于ESR1、NR1H2、NR1H3、AR 靶蛋白調節SUMO 結合酶UBE2I 的生成，進而影響PPARA、NR3C1 等疾病相關靶點蛋白的SUMO 化修飾。蛋白質的SUMO 化修飾類似于蛋白質的泛素化修飾，可以改變底物蛋白的諸多特征，如細胞內亞定位、酶活性、蛋白質結構和穩定性、轉錄活性[28]。UBE2I在SUMO 化修飾過程中起到至關重要的作用，除了能提供活化形式的SUMO 蛋白，還可直接將SUMO接合到特異性底物的賴氨酸殘基上。雷公藤通過影響UBE2I的循環途徑起到了調節轉錄因子PPARG 和NR3C1 活性的作用。4）調節第二信使PIP3 的生成，影響B 細胞的活化。異黃酮醇通過作用于ESR1、ESR2 調節第二信使PIP3 的生成，從而影響疾病靶點蛋白BTK、SYK 參與的信號轉導過程。BTK、SYK 都是酪氨酸激酶，與B 淋巴細胞的BCR 信號轉導有關，能夠影響B 細胞的活化[29]。雷公藤通過調節PIP3的生成起到了調節B細胞免疫功能的作用。

2.5 作用機制網絡的子圖分析

對上述的作用機制網絡圖的進行整體分析只能獲得一部分信息，要獲得雷公藤有效成分影響RA疾病相關靶點的詳細機制還需要對作用機制網絡圖進行子圖分析。以1 個子圖為例，對其進行分析，見圖3。

如圖3 所示，雷公藤的有效成分白樺脂酸通過反應1 和反應2 影響疾病靶點SYK。白樺脂酸是一種天然的五環三萜類化合物，具有抗炎、抗瘧疾、抗艾滋病和抗腫瘤活性[30-32]。PTPN1是一類酪氨酸蛋白磷酸酶，在多個通路中發揮著重要的調節作用，如介導肝細胞生長因子受體（Met）的去磷酸化[33]。已有研究表明，白樺脂酸是PTPN1的抑制劑[34]。

反應1 為整合素alphallb beta3 復合物的去磷酸化反應，由PTPN1 磷酸酶催化[35]。復合物1 為反應1的產物，其為整合素alphallb beta3 復合物SRC 酪氨酸殘基530 位點去磷酸化后的狀態。反應2 為alphallb beta3 復合物的自磷酸化反應，該復合物聚集后激活了自身SRC 酪氨酸殘基419 位點[36]，產生了復合物2。反應1 和反應2 都是整合素信號通路下的反應。

SYK 可參與各種跨膜受體下游的信號轉導，包括經典免疫受體，如BCR[37]。SYK 還參與多種生物過程的調節，包括先天性和適應性免疫、細胞黏附、破骨細胞成熟、血小板活化和血管發育[38-39]，被認為是潛在的自身免疫病治療靶點[40]。在圖3 中，SYK結合于復合物2 的beta3 尾部[41]，隨后由復合物3 上的SRC激活[42]，進而參與下游的各種信號轉導通路。

圖3 有效成分白樺脂酸影響疾病相關靶點SYK的機制子圖

整體來看，PTPN1 所催化產生的產物與SYK 結合而激活了SYK 的活性，而雷公藤的有效成分白樺脂酸是PTPN1 的抑制劑，因此雷公藤的有效成分白樺脂酸通過抑制PTPN1 而阻止了SYK 與整合素alphallb beta3 復合物的結合，進而阻止了SYK 的活化，從而最終調節了RA的疾病狀態。

目前，PTPN1 并未成為RA 的治療靶點，但是有研究發現PTPN1是治療免疫缺陷病的潛在靶點[43]。本研究解析發現，通過抑制PTPN1可以抑制SYK 的活化，這表明PTPN1或許治療RA的潛在疾病靶點。

3 總結與展望

雷公藤治療RA 的機制研究一直備受關注。有研究者基于計算機模擬，利用化學空間和分子對接理論探索雷公藤治療RA 的分子作用機制[44]，發現雷公藤主要通過抗炎、調節免疫應答、抑制骨破壞來調節疾病狀態；有研究者基于網絡藥理學探索雷公藤多苷治療關節炎的機制[45]，發現了雷公藤多苷影響到的生物學通路主要是炎癥反應和免疫調節通路；有研究者基于網絡藥理學探索雷公藤影響骨破壞的作用機制[46]；也有研究者整合化學物質組學和網絡藥理學研究雷公藤片治療RA 的作用機制[47]，發現雷公藤主要作用于免疫系統、有機物和細胞因子等多個生物過程。綜合來看，上述的研究主要基于計算機模擬和網絡藥理學來系統探索雷公藤治療RA 的作用機制，發現雷公藤作用機制有一定的共同點，即雷公藤主要通過影響免疫調節和骨破壞通路來起到治療作用。但是，以上研究未能關注到雷公藤化學成分對RA 疾病相關蛋白的間接作用機制，而藥物對疾病相關蛋白的間接作用也是藥物治療疾病的重要方式之一[48]。此外，上述研究所使用的疾病相關蛋白中，有一部分在B 淋巴細胞中并未表達，如MMP13、MMP1、MMP2、Mu型阿片受體（OPRM1）、黃嘌呤脫氫酶（XDH）、電子選擇素（SELE）、細胞色素P450 1A2（CYP1A2）等。因此，在使用同樣的方法研究雷公藤對某一特定類型細胞的作用機制時會有所不足。與上述研究相比，本研究則較好地彌補了其不足之處。

本研究發現雷公藤主要通過影響B 淋巴細胞轉錄因子的活性、細胞活化及胞外信號傳遞起到治療RA的作用；并以一個子圖為例詳細闡述了雷公藤作用靶點PTPN1和疾病相關靶點SYK 之間的聯系，將細胞的基因、蛋白質、小分子、復合物和信號分子數據進行了有效整合，充分體現出了生物網絡的系統性。此外，本研究推理所使用的背景網絡都是基于真實實驗數據所構建的，可以對中藥作用的細胞內生物過程的因果關系進行細致描述，所得結果真實性、可靠性強。不過，由于目前缺乏針對單一細胞的生化反應數據庫及中藥的靶點信息，本研究難免會有一些局限性。相信隨著未來中醫藥及現代科學的發展，這些問題將會被逐一解決。