Box-Behnken響應面法優化厚樸溫中湯提取工藝△

申若男，羅菊元，張晴，劉雪純，胡文均，張澤康，王昌海，陸洋，2*，白潔*

1.北京中醫藥大學 中藥學院，北京 102488；2.深圳北京中醫藥大學研究院，廣東 深圳 518000

《內外傷辨惑論》中記載，厚樸溫中湯是由姜厚樸、橘紅、炙甘草、草豆蔻、木香、茯苓、干姜、生姜8 味中藥組成[1]，功效主要為溫中行氣、燥濕除螨，現代臨床上常用于治療脾胃虛寒型胃痛等[2-3]。將經典名方開發為顆粒劑等現代制劑，不僅能推動經典名方的傳承與發展，也能方便臨床用藥。

與傳統中藥新藥研究以指標性成分最優為目的的工藝不同，在經典名方顆粒劑的制備工藝中，不是以參數值最大為目標，而是要保證關鍵質量屬性符合基準樣品質量標準的范圍[4]。而指紋圖譜、指標性成分、出膏率作為關鍵質量屬性，需同時滿足基準樣品質量標準范圍。

本研究制備了15 批厚樸溫中湯基準樣品對應實物，并確定了關鍵質量屬性的范圍。響應面法可以確定因素水平在其相應的范圍之內[5]，使其最終得到的工藝參數符合基準樣品質量標準范圍。因此，本研究在單因素試驗基礎上，選擇響應面法優化提取工藝，為后續現代制劑的開發研究提供參考。

1 材料

1.1 儀器

BSA 224S 型萬分之一電子分析天平［賽多利斯科學儀器（北京）有限公司］；JM-B100002 型十萬分之一電子天平（余姚市紀銘稱重校驗設備有限公司）；KQ5200DA型數控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；FD-2A 型真空冷凍干燥機（北京博醫康實驗儀器有限公司）；SHB-Ⅲ型循環真空泵（鄭州長城科工貿有限公司）；HH-6型電熱恒溫水浴鍋（北京科偉永興儀器有限公司）；UltiMate U3000型高效液相色譜儀［賽默飛世爾科技（中國）有限公司］；DZF-6051 型真空干燥器（北京利康達圣科技有限公司）。

1.2 試藥

對照品厚樸酚（批號：110729-201714，純度：100.0%）、橙皮苷（批號：110721-201818，純度：96.2%）、甘草酸銨（批號：110731-201720，純度：97.7%）、喬松素（批號：111829-201703，純度：99.5%）均購于中國食品藥品檢定研究院；乙腈、甲醇、磷酸（Fisher 公司，色譜純）；純凈水（杭州娃哈哈集團有限公司）。

姜厚樸飲片（批號：YP-HP-201801-2，產地：四川綿陽）；橘紅飲片（批號：201920-4，產地：福建龍巖）；炙甘草飲片（批號：YP-GC-201804-1，產地：甘肅武威）；木香飲片（批號：YP-MX-DL-5，產地：云南大理）；草豆蔻飲片（批號：CDK-201804-5，產地：海南萬寧）；茯苓飲片（批號：FL-201802-1，產地：安徽六安）；干姜飲片（批號：201802-1，產地：山東臨沂）；生姜（批號：SJ-202009-5，產地：山東煙臺），以上飲片均由億帆醫藥股份有限公司提供，均經北京中醫藥大學劉春生教授鑒定。

2 方法與結果

2.1 厚樸溫中湯基準樣品對應實物的制備

按厚樸溫中湯處方量分別稱取7味飲片最粗粉及生姜3片（總質量4～5 g）于陶瓷鍋中，加入水300 mL，武火加熱至沸騰后轉文火煎煮30 min，以4層脫脂紗布作為濾材進行濾過，濾液放涼后調整至250 mL。精密移取水煎液5 mL 至西林瓶中，-20 ℃預冷凍24 h后轉移至真空冷凍干燥機（-80 ℃，10 Pa），冷凍2 d，即得厚樸溫中湯基準樣品對應實物[6]。

2.2 橙皮苷、甘草酸、喬松素及厚樸酚含量測定方法的建立

2.2.1 對照品溶液的制備 精密稱取適量的橙皮苷、甘草酸、喬松素、厚樸酚對照品，分別加甲醇定容至質量濃度分別為1040、1346、133、1070 μg·mL-1的對照品母液。

2.2.2 供試品溶液的制備 取1 份凍干粉樣品，加70%甲醇5 mL，超聲15 min（200 W，40 kHz），搖勻后取樣，用于測定橙皮苷、甘草酸、喬松素、厚樸酚含量。

按照處方量稱取飲片，同法分別制備姜厚樸、草豆蔻、橘紅、炙甘草陰性樣品溶液。

2.2.3 色譜條件 Thermo Acclaim?120-C18120 ?（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動相為乙腈（A）-0.1%磷酸水溶液（B），梯度洗脫（0～6 min，2%～7%A；6～10 min，7%～9%A；10～15 min，9%A；15～35 min，9%～13%A；35～40 min，13%A；40～54 min，13%～19%A；54～66 min，19%～29%A；66～103 min，29%～80%A；103～108min，80%A）；流速：1mL·min-1；檢測波長：230 nm；柱溫：30 ℃；進樣量：10 μL。

2.2.4 指標性成分含量測定方法學考察 根據《中華人民共和國藥典》2020年版[7]，按照2.2.3項下色譜條件對橙皮苷、甘草酸、喬松素、厚樸酚進行含量測定方法學考察，結果見表1、圖1～4。結果可以得出各考察指標均符合實驗要求。

圖1 厚樸溫中湯中橘紅飲片特征峰

表1 厚樸溫中湯指標性成分含量測定方法學考察

2.3 基準樣品出膏率的測定

按2.1項下方法制備基準樣品后，取剩余水煎液樣品245 mL 移入蒸發皿中，常壓恒溫水浴100 ℃濃縮至近干后，置減壓真空干燥箱中60 ℃干燥24 h，得藥材干膏，按公式（1）計算得出膏率。

圖2 厚樸溫中湯中炙甘草飲片特征峰

圖3 厚樸溫中湯中草豆蔻飲片特征峰

圖4 厚樸溫中湯中姜厚樸飲片特征峰

2.4 單因素試驗初步篩選提取工藝

為客觀反映各個因素對提取工藝的影響，以橙皮苷、甘草酸、喬松素、厚樸酚含量及出膏率為指標，并設立綜合評分進行考察。按公式（2）計算綜合評分。

固定提取時間為30 min，考察不同的加水量（300、600、900、1200 mL）及固定加水量600 mL，考察不同的提取時間（15、30、60、90 min）進行單因素試驗，結果見表2～3。由表2可知，隨著加水量的增加，指標性成分的含量、出膏率及綜合評分增加漸緩，所以將響應面加水量高水平定為1200 mL；由表3 可知，隨提取時間的延長，橙皮苷、甘草酸、喬松素及厚樸酚的含量增加漸緩，所以將提取時間高水平定為90 min。

表2 不同加水量對指標性成分質量分數、出膏率及綜合評分的影響

表3 不同提取時間對指標性成分質量分數、出膏率及綜合評分的影響

2.5 Box-Behnken法優化厚樸溫中湯提取工藝

因厚樸溫中湯處方中除炙甘草和茯苓外，其余藥味均為芳香類中藥，含小極性成分較多，其在水中溶解度較低，若直接測定厚樸溫中湯水煎液，則樣品中多個藥味的特征峰無法得到體現。為了盡可能全面地反映厚樸溫中湯樣品的質量信息，參照基準樣品水煎液測定前處理方法，采用凍干粉復溶后進樣。

利用Design Expert 10 軟件進行四因素三水平的27 次試驗（中心點選擇重復3 次），因素水平見表4。

表4 Box-Behnken響應面法優化厚樸溫中湯提取工藝的四因素三水平試驗設計

2.5.1 試驗結果 27 組試驗提取液凍干粉中的指標性成分含量和出膏率見表5。

表5 Box-Behnken響應面法優化厚樸溫中湯提取工藝的試驗設計與結果

2.5.2 模型的建立與評價 根據上述27 組的試驗結果，采用二階多項式模型進行方程擬合，回歸方程：綜合評分=0.77+0.067A -0.053B+0.14C+0.32D -0.062AB -0.043AC+0.20AD+0.057BC+0.073BD+0.37CD。對擬合模型進行ANOVA方差分析，由表6 可知，模型方差差異有統計學意義（P＜0.05）。失擬項是用來評估模型是否可靠的重要數據，本次模型的失擬項P值為0.383 6＞0.05，失擬值不顯著，表明所建模型有統計學意義，可以較好地將模型與實際值擬合在一起[8]。模型相關系數為0.750 5，說明絕大部分響應值的變化均可由該模型來進行解釋，可以運用該模型進行分析。

由表6 可知，因素C 的P＜0.05，說明提取時間對綜合評分差異有統計學意義。且各影響因素之間還存在交互作用，不同交互因素與綜合評分的響應面分析見圖5～10。而因素D、CD 的P＜0.001，且圖10 中響應面圖坡度較陡，更加表明了提取時間和提取次數對綜合評分有非常顯著的影響。

圖5 加水量和浸泡時間對厚樸溫中湯最優提取工藝綜合評分影響的響應面圖及等高線圖

表6 Box-Behnken響應面法預測厚樸溫中湯最優提取工藝回歸模型方差分析結果

2.5.3 預測最優工藝 經過預測得到的厚樸溫中湯最優提取工藝為加水13.155 倍，浸泡32.486 min，提取30 min，提取3 次。此條件下的綜合評分為0.486。根據實際情況為了方便后續實驗，將工藝調整為加水13 倍（780 mL），浸泡30 min，提取30 min，提取3 次，驗證優選工藝的可行性。

2.5.4 驗證實驗 按照預測的工藝參數進行驗證實驗，對結果進行綜合評分，結果見表7。由表7 可知，按照預測工藝提取后，其結果均能接近預測值，甚至較響應面法預測值更低，同時可保證指標性成分橙皮苷、甘草酸、喬松素和厚樸酚的含量在基準樣品值的70%～130%，更好地確保了制劑與基準樣品質量的一致性。且驗證實驗與基準樣品對應實物的對照圖譜的相似度為0.999（圖11），相似度良好。

圖11 厚樸溫中湯基準樣品與驗證實驗圖譜

表7 Box-Behnken響應面法優化預測厚樸溫中湯最優提取工藝的驗證實驗結果

3 討論

《古代經典名方中藥復方制劑及其物質基準的申報資料要求（征求意見稿）》指出，研究飲片到基準樣品的量值傳遞關系應從指紋圖譜、浸出物或特征圖譜、含量測定等方面切入[9]。同樣，在將經典名方制備為顆粒劑的過程中，也應比較研究基準樣品與顆粒劑之間的量值傳遞關系，主要對基準樣品指標性成分含量、特征圖譜相似度及出膏率這3 個指標進行質量控制。

圖6 加水量和提取時間對厚樸溫中湯最優提取工藝綜合評分影響的響應面圖及等高線圖

圖7 加水量和提取次數對厚樸溫中湯最優提取工藝綜合評分影響的響應面圖及等高線圖

采用了層次分析法（AHP）確定綜合評分時各個指標分配的比例，AHP 是一種非常方便、靈活的數學決策方法，具有多維準則。其充分利用了人類的經驗和判斷能力，將復雜的問題系統化、量化，從而對決策方案進行排序。AHP 主要將多個因素作為研究對象，每個因素又屬于不同層次，具有遞階性[10]。厚樸溫中湯主要有2 個層次：指標性成分和出膏率。姜厚樸為處方主藥，厚樸酚作為姜厚樸中的主要藥效成分且含量最高；喬松素是方中臣藥草豆蔻的主要藥效成分；橙皮苷是方中佐藥橘紅的主要藥效成分；甘草酸是方中佐使藥炙甘草的主要藥效成分。在綜合評分的比例分配上，由于各指標性成分在方中均起著重要作用，且出膏率也是作為衡量制劑質量的重要指標，所以對綜合評分的評價設立了5 個占比相同的指標。

圖8 浸泡時間和提取時間對厚樸溫中湯最優提取工藝綜合評分影響的響應面圖及等高線圖

圖9 浸泡時間和提取次數對厚樸溫中湯最優提取工藝綜合評分影響的響應面圖及等高線圖

圖10 提取時間和提取次數對厚樸溫中湯最優提取工藝綜合評分影響的響應面圖及等高線圖

以提取時間、浸泡時間、提取次數、加水量4 個因素作為響應面法中單因素試驗的設計因素。隨著時間的延長，有效成分也會逐漸被提取，再增加提取次數也難以較大地改變成分的含量[11]，所以直接將提取次數的3 個水平設定為1、2、3次。響應面法可以快速、有效地減少試驗次數，規定各個指標均在其相應范圍內并且可以更加直觀地體現出各個因素之間的交互作用[12]。采用響應面法來優選提取工藝時，驗證實驗的結果均能達到預測值，表明該預測工藝能達到提取工藝的預期目標。最終確定的厚樸溫中湯提取工藝：提取30 min，浸泡30 min，提取3 次，加水量780 mL。在此工藝條件下得到的厚樸溫中湯制劑中指標性成分含量與基準樣品對應實物含量相接近，且在70%～130%離散范圍內，說明該工藝可行，可以作為后續實驗中制劑的提取方法。