醛縮酶B在果糖耐受與血糖穩態中的作用研究*

馮瀅櫻， 史亞男， 麻獻華， 陳玉霞， 章衛平，△

醛縮酶B在果糖耐受與血糖穩態中的作用研究*

馮瀅櫻1， 史亞男1， 麻獻華2， 陳玉霞2， 章衛平1，2△

（1天津醫科大學朱憲彝紀念醫院，天津市內分泌研究所，國家衛健委激素與發育重點實驗室，天津市代謝性疾病重點實驗室，天津 300134；2海軍軍醫大學病理生理學教研室，上海 200433）

建立全身性醛縮酶B（aldolase B，）基因敲除小鼠模型，探討基因缺陷對小鼠果糖耐受和血糖穩態的影響。利用敲除優先策略和胚胎干細胞基因打靶技術，建立全身性基因敲除小鼠模型，并通過Western blot驗證敲除效果；監測普食喂養小鼠生長發育過程中的體重、體長、血糖和血脂水平；檢測果糖灌胃前后小鼠血糖及血漿天冬氨酸轉氨酶（aspartate aminotransferase， AST）和丙氨酸轉氨酶（alanine aminotransferase， ALT）水平，取材分析肝、腎等器官的大小及形態學變化。缺陷小鼠普食喂養時出現生長遲滯和低血糖；果糖灌胃后血糖呈降低趨勢，血漿AST和ALT水平升高，并伴有肝腎腫大和肝臟病理性損傷。Aldob在維持小鼠生長、血糖穩態和果糖耐受性中發揮重要作用。

醛縮酶B；基因敲除；生長發育；果糖耐受；血糖穩態

體內的果糖主要從膳食中攝入，少量由山梨醇途徑產生。果糖攝入過量與肥胖、糖尿病和非酒精性肝病等代謝性疾病的發生發展密切相關［1-3］。內源性果糖產生過多也參與代謝性疾病的病理生理過程［4］。醛縮酶B（aldolase B， Aldob）是介導果糖分解代謝的關鍵酶，主要負責催化1-磷酸果糖（fructose-1-phosphate， F-1-P）裂解為磷酸二羥丙酮和甘油醛。Aldob在肝臟、腎臟以及小腸組織中高表達，其表達水平受激素和營養因素的影響，是轉錄因子碳水化合物反應元件結合蛋白（carbohydrate response element-binding protein， ChREBP）的直接靶基因［5-7］。

人基因突變可導致遺傳性果糖不耐受（hereditary fructose intolerance， HFI），屬于常染色體隱性遺傳病，患者主要表現為果糖攝入后惡心、嘔吐、腹痛、黃疸等癥狀，哺乳期患兒還可出現低血糖、昏迷和肝腎衰竭，嚴重時可危及生命，其機制推測與F-1-P積聚、糖原分解和葡糖異生功能障礙有關［8-9］。為深入探討缺陷的病理學意義及其相關機制，我們建立了基因敲除小鼠模型，并重點觀察了缺失對小鼠個體生長、糖代謝和果糖耐受性的影響。

材料和方法

1　材料

基于敲除優先（knockout first， KF）基因打靶策略建立含Aldob等位基因的胚胎干細胞（embryonic stem cell， ESC），克隆號為EPD0830-3-H05，從劍橋-蘇大基因組資源中心獲得，并委托該中心進行囊胚注射，獲得雜合子小鼠（Aldob）。Aldob等位基因由于第2個內含子中插入報告基因和新霉素抗性基因（）而失活；和基因可通過FLP介導的FRT同源重組而被剔除。Aldob小鼠引入后經交配獲得全身性敲除（knockout， KO）的純合子小鼠Aldob；用同窩同性別野生型（wild-type， WT）小鼠作為對照。小鼠飼養于SPF級動物房，環境溫度25 ℃，濕度40%～70%，12 h光照/12 h黑暗。幼鼠于4周齡離乳，此后給予普通飼料喂養。

2　方法

2.1PCR基因型鑒定用蛋白酶K消化法提取鼠尾基因組DNA，并進行PCR基因型鑒定［10］。野生等位基因的PCR擴增引物為5'-GTTTGGACCTGCTGCTAAGGAGAAT-3'（正義鏈）和5'-GCCAGCCAGTGCTATACTGTTGTCT-3'（反義鏈），AldobF等位基因的擴增引物為5'-GTTTGGACCTGCTGCTAAGGAGAAT-3'（正義鏈）和5'-ACTGACCTTGGGCAAGAACATAAAG-3'（反義鏈）；其擴增產物分別為475 bp和329 bp。PCR擴增條件為：95 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35個循環。

2.2血生化檢測隨機血糖于上午10～11點尾尖采血，用血糖儀檢測。采血過程中盡量保持周圍環境安靜，避免刺激小鼠。血漿甘油三酯用Sigma生化檢測試劑盒檢測。肝臟甘油三酯含量經丙酮提取后測定，并用肝重進行標化［6］。肝臟糖原經提取后用BioAssay Systems的試劑盒測定［7］。血漿天冬氨酸轉氨酶（aspartate aminotransferase， AST）和丙氨酸轉氨酶（alanine aminotransferase， ALT）活性用全自動生化儀（Mindray BS-240）檢測。

2.3果糖耐受性試驗及組織取材7周齡成年小鼠禁食4 h后尾尖采血，用血糖儀檢測空腹血糖，然后在清醒狀態下給與30%果糖水灌胃（2 mg/g體重），于灌胃后15 min、30 min、60 min檢測血糖水平。小鼠經4%水合氯醛麻醉后，眼眶抗凝采血，離心后留取血漿于-80 ℃保存；留取部分肝臟、腎臟及空腸，經液氮速凍后保存于-80 ℃，并留取部分組織經4%多聚甲醛固定后石蠟包埋，進行形態學分析。

2.4Western blot干冰上取10～20 mg組織，加入尿素裂解液（25 mmol/L Tris-HCl， 8 mol/L尿素， 1% SDS， 1 mmol/L EDTA， 0.7 mol/L DTT， pH 7.4）后進行低溫勻漿，離心收集裂解液上清［11］；并加入上樣緩沖液進行SDS-PAGE，隨后冰上進行轉膜。轉膜結束后將PVDF膜用5%的脫脂牛奶室溫封閉1 h。用抗Aldob兔多克隆抗體或抗β-actin小鼠單克隆抗體（Proteintech）孵育過夜（抗體稀釋比例為1∶5 000），TBST緩沖液漂洗3遍，分別加入辣根過氧化物酶標記的羊抗兔或羊抗小鼠（Jackson）多克隆抗體（抗體稀釋比例為1∶5 000），室溫孵育1 h，TBST緩沖液漂洗3遍，加入化學發光ECL試劑（Pierce）顯影后，用LAS-4000化學發光檢測儀（Fuji）進行曝光。

2.5HE染色取小鼠肝臟組織用4%多聚甲醛溶液進行固定，脫水包埋后于4 ℃保存。脫臘后，使用蘇木精染核5 min，隨后ddH2O沖洗，用0.1%氨水堿化10 s后再次ddH2O沖洗，隨后浸入95%乙醇1 min后，用伊紅細胞染色2 min，再依次浸入95%乙醇、無水乙醇、二甲苯，各2次，每次1 min。封片后進行顯微鏡拍照。

3　統計學處理

數據處理及作圖采用GraphPad軟件。數據以均數±標準誤（mean±SEM）來表示。實驗數據統計推斷采用配對檢驗。以<0.05為差異有統計學意義。

結果

1　全身性Aldob基因敲除小鼠模型的建立

利用KF策略，首先獲得攜帶插入失活Aldob等位基因的雜合子小鼠（圖1A）。經雜合子小鼠獲得Aldob純合子，即全身性基因敲除小鼠。小鼠基因型通過基因組的PCR分析進行鑒定（圖1B）。Western blot結果顯示，Aldob蛋白在WT小鼠的肝臟和空腸組織中表達，而在KO小鼠組織中則完全消失（圖1C），表明成功建立了全身性基因敲除小鼠模型。

Figure 1.　Generation of the global Aldob gene knockout mouse model. A： schematic demonstration for the generation of Aldob gene knockout mouse model； B： representative demonstration for PCR-based genotyping with tail genomic DNA； C： Western blot analysis for Aldob protein expression in the liver and jejunum.

2　Aldob基因敲除導致小鼠生長遲緩和低血糖

為觀察缺陷對小鼠生長發育的影響，我們從哺乳期開始動態監測了小鼠體重的變化。與同窩野生對照相比，哺乳期3周齡的KO幼鼠體重即明顯降低；幼鼠于4周齡離乳后給予普通飼料喂養，對照小鼠體重呈現快速增長趨勢，而KO小鼠體重并沒有顯著增加（圖2A），鼻肛間體長也顯著變短（圖2B）；至8周齡成年時體重基本維持在7 g以下，僅為對照小鼠的1/3左右（圖2C）。這表明缺陷小鼠生長嚴重遲滯。

Figure 2.　The chow-fed Aldob-null mice exhibited growth retardation and hypoglycemia. A： body weight； B： body length； C： representative mouse photo at 6 weeks of age； D： blood glucose level under the fed condition. Mean±SEM. n=4. *P<0.05，**P<0.01 vs WT group.

為分析敲除小鼠生長遲滯的可能原因，我們檢測了小鼠糖脂代謝穩態的變化。結果顯示，離乳前的3～4周齡KO小鼠隨機血糖維持在5～8 mmol/L，與WT對照小鼠相比無顯著差異；然而在離乳后的5～8周齡，KO小鼠表現為持續性嚴重低血糖，隨機血糖水平維持在4 mmol/L左右，僅為對照小鼠的一半，甚至更低（圖2D）。饑餓4 h后取材分析結果顯示，成年KO小鼠的空腹血糖明顯低于對照組，兩組小鼠的肝糖原均未檢測到，血漿和肝臟甘油三酯水平無顯著差異，KO小鼠的血漿ALT和AST水平顯著升高（表1），提示存在肝損傷。這些結果提示離乳后的低血糖可能與KO小鼠生長遲滯有關。

表1　普食成年小鼠饑餓4 h后血和肝臟指標

BW： body weight； ND： undetected.**<0.01WT group.

3　Aldob基因敲除導致小鼠對果糖不耐受

我們進一步分析了缺陷對成年小鼠果糖耐受性的影響。如圖3A所示，對照小鼠在經果糖水灌胃后15 min血葡萄糖水平明顯升高，提示果糖經腸道吸收后，經葡糖異生為葡萄糖；而KO小鼠在果糖灌胃后血糖反而呈下降趨勢，部分KO小鼠在果糖灌胃后90 min內死亡，提示其對果糖不耐受。生化分析顯示，灌果糖水后的KO小鼠血漿AST和ALT水平進一步升高，遠高于WT小鼠（圖3B），提示果糖負荷進一步加重KO小鼠的肝損傷。與WT小鼠相比，KO小鼠肝和腎的外表失去正常鮮紅色，略發黃（圖4A），絕對重量有降低趨勢，但差異無統計學意義（圖4B），經體重標化后的肝體重比和腎體重比均明顯增加（圖4C），提示存在肝腎腫大；HE染色顯示，KO小鼠肝小葉結構紊亂，肝索結構破壞，局部病灶炎癥細胞浸潤（圖4D）；生化分析顯示，肝糖原含量［WT：（21.16±6.12） mg/g BW； KO：（22.5±5.71） mg/g BW］和肝甘油三酯含量［WT：（15.13±3.8） mg/g BW； KO：（19.63±10.27） mg/g BW］均無顯著變化。上述結果表明缺陷導致小鼠對果糖不耐受。

Figure 3.　Aldob-null mice were fructose intolerant. Seven-week-old male mice were challenged with fructose by gavage， and sacrificed 60 min later. A： blood glucose level； B： plasma ALT and AST levels. Mean±SEM. n=4～5. **P<0.01.

Figure 4.　Pathological changes of the liver and kidney in Aldob-null mice after fructose challenge. A： the photos of the liver and kidney； B： body and organ weight； C： the ratio of liver or kidney weight to body weight； D： the representative images of HE staining for the liver， with the pathological change indicated by dotted box， and inflammatory cell infiltration indicated by white arrow heads. Mean±SEM. n=5. *P<0.05，**P<0.01 vs WT group.

討論

本研究建立了全身性基因敲除小鼠，發現缺陷小鼠在普食喂養過程中出現嚴重的生長遲滯和低血糖，并且對果糖不耐受，這些表型特征與HFI患兒的臨床表現相符［12］，表明該小鼠模型對研究HFI致病機制具有應用價值。既往文獻中發現基因敲除幼鼠在離乳時體重有下降的趨勢，離乳后在無果糖飼料喂養時體重基本恢復正常，但沒有交代離乳后普食喂養時小鼠生長發育的變化［8］。我們發現，缺陷不僅導致哺乳期幼鼠體重明顯低于同窩對照，而且在離乳后普食喂養時生長嚴重遲滯，推測該表型可能與普通飼料中含有微量的果糖有關，提示生長發育期的缺陷幼鼠對果糖的病理損傷作用非常敏感，因此HFI患兒生長發育遲滯也可能與果糖暴露有關。除膳食果糖暴露以外，鑒于機體尤其在大量攝入碳水化合物時可產生內源性果糖［4］，內源性果糖暴露也需引起重視。值得注意的是，敲除小鼠在生長發育期就表現為嚴重低血糖，這可能是導致其生長發育障礙的部分原因，但是3～4周齡敲除幼鼠在血糖還基本正常時就出現體重下降的表型，提示低血糖以外的原因可能在生長發育障礙中發揮了重要作用。因此，該小鼠模型的建立為進一步深入研究缺陷影響生長發育的細胞分子機制提供了重要手段。

我們的結果也證實了在果糖代謝中的重要作用。既往研究顯示缺陷小鼠在高果糖飲食條件下可出現嚴重肝損傷，甚至死亡［8］。我們發現普食喂養的成年敲除小鼠在給與一次性果糖負荷后，血糖呈下降趨勢，并可在90 min內導致小鼠死亡，表明其果糖代謝存在明顯障礙。高劑量的果糖經腸道上皮Glut5轉運子吸收后，一方面可激活腸道ChREBP通路和果糖吸收能力，通過葡糖異生途徑直接在小腸上皮細胞中轉化為葡萄糖吸收入血［13］，而腸道ChREBP也可通過果糖反應性激活小腸上皮細胞表達Glut5［14］；另一方面經門靜脈吸收的果糖在肝臟和腎臟中通過葡糖異生產生葡萄糖，從而導致血糖升高［15-16］。Aldob是介導F-1-P裂解的唯一醛縮酶，其缺陷導致F-1-P的大量蓄積，造成細胞毒性和肝損傷。我們觀察到的血漿轉氨酶ALT和AST水平升高也得到了證實。盡管糖原過度蓄積也可能導致果糖代謝應激相關的肝臟損傷［7］，我們在果糖負荷的敲除小鼠肝臟中并未檢測到糖原含量升高。缺陷小鼠在高果糖喂養時可出現脂肪肝［8］，我們觀察到少部分敲除小鼠在普食喂養時也會出現脂肪肝和肝損傷。我們推測普食喂養時敲除小鼠的肝損傷和生長遲滯可能主要與細胞內F-1-P蓄積有關，而抑制其體內F-1-P的產生可望緩解果糖導致的細胞毒作用［17］。

鑒于體內果糖代謝涉及腸道、肝臟和腎臟等多個器官，闡明缺陷導致果糖代謝障礙的細胞分子機制無疑需要利用其組織特異性敲除小鼠模型。我們利用敲除優先策略構建的Aldob小鼠可通過與FLP轉基因小鼠交配［18］，獲得Aldob小鼠及后續的條件基因打靶研究。另外，Aldob等位基因攜帶LacZ報告基因，可直接通過X-Gal染色檢測啟動子活性，間接分析基因在果糖代謝中的時空表達激活特征。此外，近年來發現Aldob及其介導的果糖代謝與結腸癌、肝癌等惡性腫瘤的發生發展密切相關［19-20］，我們所獲得的Aldob小鼠在腫瘤研究中也具有潛在的應用價值。

總之，我們成功建立了基因敲除小鼠模型，研究發現Aldob是維持小鼠在普食環境下的正常生長發育、糖脂代謝穩態和果糖耐受性所必需的，為進一步深入研究其細胞分子機制奠定了基礎。

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Role of aldolase B in fructose tolerance and glucose homeostasis in mice

FENG Ying-ying1， SHI Ya-nan1， MA Xian-hua2， CHEN Yu-xia2， ZHANG Wei-ping1，2△

（1，，，300134，；2，，200433，）

To generate a mouse model of global aldolase B （） gene knockout， and to examine its phenotypes of glucose homeostasis and fructose tolerance.The knockout-first gene targeting strategy was used to generategene knockout mice， and the deletion efficiency was verified by Western blot. The chow-fed mice were dynamically monitored for the body weight and blood glucose level. After fructose challenge by gavage， the changes of blood glucose and plasma aspartate aminotransferase （AST） and alanine aminotransferase （ALT） levels were biochemically analyzed， and the liver and kidney were examined for the mass and morphological alterations.Theknockout mice showed a complete loss of Aldob protein in the liver and jejunum， and exhibited severe growth retardation and hypoglycemia on chow diet. Adult-null mice were intolerant to fructose challenge， as manifested by decreased blood glucose level as well as elevated plasma AST and ALT levels， and even lethality. The mutant mice had enlarged liver and kidney as well as overt liver injury.The Aldob is required for the growth， glucose homeostasis and fructose tolerance in mice.

Aldolase B； Gene knockout； Growth and development； Fructose tolerance； Glucose homeostasis

Q591.4； R363.2

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2022.06.011

1000-4718（2022）06-1040-06

2022-05-05

2022-06-02

國家自然科學基金重大研究計劃（No. 91857203）

Tel： 021-81871018； E-mail： zhangwp@tmu.edu.cn

（責任編輯：余小慧，李淑媛）