2個大豆VOZ轉錄因子的克隆及非生物脅迫表達分析

鄔長樂，張軍，何佳琦，李銘楊，于海偉，李珊珊，翟瑩

2個大豆VOZ轉錄因子的克隆及非生物脅迫表達分析

鄔長樂1，2，張軍3，何佳琦1，2，李銘楊1，2，于海偉1，2，李珊珊1，2，翟瑩1，2

（齊齊哈爾大學 1. 生命科學與農林學院，2. 抗性基因工程與寒地生物多樣性保護黑龍江省重點實驗室，黑龍江 齊齊哈爾 161006；3. 黑龍江省農業科學院 畜牧獸醫分院，黑龍江 齊齊哈爾 161005）

為探究大豆維管植物鋅指蛋白（VOZ）轉錄因子的序列特征和非生物脅迫表達模式，采用實時熒光定量PCR對，在非生物脅迫下的表達量進行檢測，并對其進行克隆及序列分析．，對干旱、高鹽、低溫脅迫均存在響應，且干旱脅迫下表達量升高最明顯．位于大豆6號染色體上，位于大豆13號染色體上，分別編碼含有478，459個氨基酸的蛋白質，它們均含有1個保守的VOZ結構域．GmVOZ1-1，GmVOZ1-2均含有1個核定位信號，預測均為細胞核蛋白．GmVOZ1-1與白羽扇豆LaVOZ的親緣關系最近，GmVOZ1-2與蒺藜苜蓿MtVOZ的親緣關系最近．

大豆；VOZ轉錄因子；非生物脅迫；表達分析

植物已經進化出復雜的調控網絡，能夠及時應對環境條件的變化．當植物遭受環境脅迫時，其體內的轉錄因子家族（如NAC，AP2/ERF，MYB，WRKY等）通過與順式作用元件的特異性結合進而調控靶基因的表達[1]．這種轉錄調控作用在植物抵御逆境及基因組信息表達過程中具有核心作用．維管植物鋅指蛋白（Vascular plant one-zinc finger protein，VOZ）是植物中廣泛存在且特有的一類轉錄因子，它們在植物進化過程中高度保守[2]．VOZ轉錄因子最早發現于擬南芥中（，），它們與擬南芥基因啟動子中的GCGTNx7ACGC回文序列區結合，調控花粉的發育[3]846-850．

近年來，VOZ轉錄因子在植物應對生物和非生物脅迫過程中發揮的作用逐漸被發現．過表達的轉基因擬南芥對凍害和干旱脅迫的耐受性降低，但對真菌的耐受性提高[4]．相反，，雙突變體對非生物脅迫耐受性增強，但對生物脅迫的耐受性降低[5]761．后續研究表明，，還可以分別作為，的轉錄抑制子，介導植物響應熱脅迫[6-7]．水稻受干旱、高溫、低溫、高鹽等多種逆境脅迫誘導表達，其超表達轉基因植株對鹽脅迫的抗性增強[8]23-46．此外，雙突變體的鋁脅迫抗性增強，它們可能作為轉錄因子的負調控因子參與水稻抗鋁毒[9]．鹽、干旱、低溫脅迫可以抑制菠蘿，的表達[10]1228．

大豆是中國五大農作物之一，其抗逆基因的篩選和鑒定對大豆抗逆基因工程育種具有重要意義．大豆VOZ轉錄因子的非生物脅迫抗性研究尚未開展．本研究從在線數據庫中獲得2個大豆VOZ轉錄因子的基因序列，對它們的非生物脅迫表達模式及序列特征進行了探究，為基因的進一步功能鑒定及應用奠定基礎．

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大豆種子（齊齊哈爾地區種植的北豆9號）；大腸桿菌DH5菌株，根癌農桿菌EHA105菌株（齊齊哈爾大學植物分子育種研究室）．

RNAiso Plus試劑，TB Green Premix ExⅡ酶，pMD18-T克隆載體（Takara公司）；cDNA反轉錄試劑盒（Novoprotein公司）．

1.2 實驗方法

1.2.1 大豆幼苗非生物脅迫處理 使用沙土與草炭土（1∶1）的混合物種植大豆種子，7 d后移入Hoagland營養液中，水培至幼苗第1片三出復葉完全展開，進行干旱、高鹽、低溫處理．將幼苗移至20%的PEG8000營養液中進行干旱脅迫處理；移至200 mmol/L的NaCl營養液中進行高鹽脅迫處理；移至4 ℃的培養箱中進行低溫脅迫處理．處理過程中，分別在不同時間點剪取0.1 g第1片三出復葉，迅速置于液氮中保存備用．

1.2.2 基因表達量檢測 使用RNAiso Plus試劑提取各時間點樣品并反轉錄成第一鏈cDNA．以cDNA為模板，大豆為內參基因[11]，使用TB Green Premix ExⅡ酶，通過實時熒光定量PCR（qPCR）檢測VOZ基因的表達量．qPCR體系反應為：2×TB Green Premix ExⅡ酶 10 μL、cDNA 2 μL、上下游引物各0.8 μL，補水至總體積20 μL．反應參數設置為：95 ℃預變性30 s；95 ℃ 5 s，58 ℃ 30 s，共循環40次．qPCR引物的設計使用Primer Premier 5軟件，引物序列見表1．所有處理進行3次重復，基因相對表達量的計算采用2-△△Ct法．

表1 qPCR和基因擴增引物序列

1.2.3 基因克隆 從植物轉錄因子數據庫PlantTFDB（http：//planttfdb.gao-lab.org/index.php?sp=Gma），NCBI數據庫（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）搜索并下載大豆VOZ轉錄因子的基因及蛋白序列．使用Primer Premier 5軟件設計，的基因擴增引物（見表1）．以大豆葉片cDNA為模板，PCR擴增，的基因編碼序列．PCR反應程序為：94 ℃ 8 min；94 ℃ 40 s，57 ℃ 40 s，72 ℃ 1 min，循環30次；72 ℃延伸8 min．回收PCR產物，連接pMD18-T克隆載體，然后送生工生物公司進行測序驗證．

1.2.4 生物信息學分析 蛋白分子量及等電點的預測使用Expasy在線軟件（https://web.expasy.org/compute_pi/）；亞細胞定位的預測使用PSORT在線軟件（https://www.genscript.com/psort.html）；植物VOZ蛋白序列下載于NCBI數據庫；蛋白序列的比對使用DNAMAN軟件；蛋白系統進化樹的構建使用MEGA5軟件．

2 結果與分析

2.1 GmVOZ1-1和GmVOZ1-2干旱、高鹽、低溫脅迫表達分析

從PlantTFDB，NCBI數據庫中獲取2個大豆VOZ轉錄因子（Genebank登錄號分別為XM003527355，XM006594138），分別命名為，，它們的功能均未被鑒定．實時熒光定量PCR結果見圖1．由圖1可見，，對干旱脅迫的應答最顯著．干旱脅迫處理后，，的表達量迅速升高，的表達量在處理2 h時達到最大值，的表達量在處理1 h時達到最大值，分別達到對照0 h的220倍和106倍（見圖1a）．高鹽脅迫處理后，的表達量先下降后升高，然后再下降，處理10 h時達到最大值，表達量為對照的2.2倍；的表達量在處理1 h后開始下降，處理24 h時表達量達到最低值（見圖1b）．低溫脅迫處理后，，的表達量均升高，的表達量在處理5 h時達到最大值，表達量在處理24 h時達到最大值，分別達到對照的7.1，4.4倍（見圖1c）．

圖1 GmVOZ1-1和GmVOZ1-2在干旱、高鹽和低溫脅迫下的表達

2.2 GmVOZ1-1和GmVOZ1-2克隆及序列分析

分別從大豆葉片cDNA中擴增獲得1 437 bp的基因編碼序列，1 380 bp的基因編碼序列（見圖2）．將，分別與克隆載體連接后經測序驗證，與NCBI數據庫中登錄序列一致．

位于大豆6號染色體上，位于大豆13號染色體上，它們分別編碼含有478，459個氨基酸的蛋白質，分子量分別為54.02，51.16 kD，等電點分別為5.56，5.83．GmVOZ1-1，GmVOZ1-2的氨基酸序列相似度達到47.62%，它們均含有1個保守的VOZ結構域（GmVOZ1-1氨基酸序列的235-451位；GmVOZ1-2氨基酸序列的193-410位）．亞細胞定位預測結果顯示，GmVOZ1-1，GmVOZ1-2的VOZ結構域中均含有1個核定位信號，均為細胞核蛋白（見圖3）．

圖2 GmVOZ1-1和GmVOZ1-2基因的PCR擴增

注：M為DNA分子量標記物2000；1為的PCR擴增；2為的PCR擴增．

圖3 GmVOZ1-1和GmVOZ1-2的氨基酸序列比對

注：方框代表預測的核定位信號；下劃線代表VOZ結構域．

2.3 GmVOZ1-1，GmVOZ1-2蛋白系統進化分析

將GmVOZ1-1，GmVOZ1-2與其它植物中的VOZ蛋白構建系統進化樹，進化關系見圖4．由圖4可見，GmVOZ1-1與白羽扇豆LaVOZ的親緣關系最近，GmVOZ1-2與蒺藜苜蓿MtVOZ的親緣關系最近，這些VOZ蛋白均來自豆科植物．

圖4 植物VOZ蛋白系統進化樹

3 討論

VOZ轉錄因子能夠調控植物應答非生物脅迫已在擬南芥[4-7]、水稻[8-9]、菠蘿[10]中得到鑒定．序列分析顯示，GmVOZ1-1，GmVOZ1-2的氨基酸序列中均含有1個保守的VOZ DNA結合結構域，該結構域也具有蛋白質二聚化功能[3]846．轉錄因子一般定位在細胞核中行使轉錄調控功能．如齒肋赤蘚具有核定位潛力及轉錄調控功能[12]．在GmVOZ1-1，GmVOZ1-2的氨基酸序列中均預測到1個核定位信號，因此推測它們為細胞核蛋白．GmVOZ1-1與LaVOZ的親緣關系最近，GmVOZ1-2與MtVOZ的親緣關系最近，推測這2個同樣來自豆科植物的VOZ轉錄因子也存在響應非生物脅迫的可能性．

，能夠在大豆幼苗中應答干旱、高鹽、低溫脅迫，推測它們的啟動子中應該含有與脅迫相關的順式作用元件或與逆境相關轉錄因子的結合位點[13]．，在非生物脅迫下的表達量均具有升高的趨勢，尤其在干旱脅迫下它們的表達量升高非常明顯，由此推測，在大豆中可能正調控非生物脅迫．這種調控方式前人也有報道，如水稻正調控水稻的鹽脅迫抗性[8]46，擬南芥正調控擬南芥的鹽脅迫抗性[14]．此外，VOZ轉錄因子在植物生物脅迫響應途徑中一般也發揮正調控的作用[4-5]．VOZ轉錄因子對植物抗逆性的影響主要通過調控靶基因實現．如，對鹽脅迫抗性的正調控是通過直接或間接的調控大量鹽脅迫響應基因的表達實現的，但在低溫脅迫下它們則負調控等逆境相關基因的表達[5]762-766．后續應進一步對，的轉基因植物進行抗性鑒定，并探索它們在逆境信號網絡中的作用及機制，從而豐富大豆抗逆基因資源．

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Clone and expression analysis of two VOZ transcription factors in soybean under abiotic stress

WU Changle1，2，ZHANG Jun3，HE Jiaqi1，2，LI Mingyang1，2，YU Haiwei1，2，LI Shanshan1，2，ZHAI Ying1，2

（1. School of Life Sciences，Agriculture and Forestry，2. Heilongjiang Provincial Key Laboratory of Resistance Gene Engineering and Protection of Biodiversity in Cold Areas，Qiqihar University，Qiqihar 161006，China；3. BranchofAnimalHusbandryandVeterinaryofHeilongjiangAcademyof AgriculturalSciences，Qiqihar 161005，China）

In order to investigate the sequence characteristics of VOZ transcription factors in soybean and their expression patterns under abiotic stress，the expression levels of，under abiotic stress were detected by real-time fluorescence quantitative PCR，and the gene cloning and sequence analysis were also carried out．，responded to drought，salt and cold stresses，and their expression levels increased most obviously under drought stress．was located on chromosome 6 of soybean and encoded a protein containing 478 amino acids．was located on chromosome 13 of soybean and encoded a protein containing 459 amino acids．The amino acid sequences of GmVOZ1-1，GmVOZ1-2 both contained a conserved VOZ domain．GmVOZ1-1 and GmVOZ1-2 both contained a nuclear localization signal，which were predicted to be nuclear proteins．GmVOZ1-1 was most closely related to LaVOZ of，and GmVOZ1-2 was most closely related to MtVOZ of．

soybean；VOZ transcription factor；abiotic stress；expression analysis

Q37

A

10.3969/j.issn.1007-9831.2022.06.014

1007-9831（2022）06-0080-05

2022-02-26

齊齊哈爾大學大學生創新創業訓練計劃項目（202110232163）；黑龍江省省屬高等學?；究蒲袠I務費科研項目（145109506）；齊齊哈爾大學研究生創新科研項目（YJSCX2020041）

鄔長樂（2001-），男，河南信陽人，在讀本科生．E-mail：wuchanglevip@icloud.com

翟瑩（1982-），女，吉林省吉林人，教授，博士，從事大豆分子遺傳育種研究．E-mail：fairy39809079@126.com