基于高通量測序的黑柄乳菇菌塘細菌多樣性分析

秦婉琳，馬永遠，李雙燕，伍 燕

（興義民族師范學院，貴州興義 562400）

黑柄乳菇（Lactarius gerardii）又名茅草菌，隸屬傘菌目（Agaricales）紅菇科（Russulaceae）乳菇屬(Lactarius)，菌蓋和菌柄呈黑褐色，菌褶白色延伸至菌柄，菌肉白色、質脆，受傷后會溢出白色乳漿，因此又叫黑蓋奶漿菌；夏季多生長在針闊混交林地上，是一種美味的野生菌[1]。圖1（參見封三）為野生黑柄乳菇子實體，采集地點為興義市萬屯鎮(zhèn)云屯生態(tài)公園松林下。乳菇屬在貴州比較常見，例如松乳菇（紫花菌）、多汁乳菇、紅汁乳菇、靚麗乳菇等[2-3]。近年研究表明，通過人工合成松乳菇菌體并接種到天然馬尾松林下，能得到松乳菇子實體[4-9]。松乳菇營養(yǎng)豐富，含多種氨基酸和微量元素，具有增強機體免疫力、抗氧化和抗腫瘤等生物活性[10-15]，松乳菇的栽培成功對開發(fā)利用黔西南地區(qū)的黑柄乳菇具有參考價值。

圖1 黑柄乳菇子實體

菌塘（Shiro）是由子實體的根部菌絲、宿主根系及周圍的腐殖質土壤扭結形成的顆粒狀結構，是真菌菌絲體萌發(fā)和形成子實體的重要條件[16-17]。深入研究菌塘，對于開發(fā)人工馴化技術，了解菇類栽培土壤細菌群的組成及豐度非常重要。本文以黔西南州的野生黑柄乳菇菌塘土壤為研究對象，高通量測序菌塘菌群后采用統(tǒng)計聚類的方法確定不同樣本優(yōu)勢菌群結構的分型，旨在探究黑柄乳菇生境土壤微生物群落特征，找出優(yōu)勢菌群、分析共性并得出規(guī)律性認識，為下一步研發(fā)黑柄乳菇的人工栽培技術奠定一些基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品采集

選取黑柄乳菇出產豐富的五個采集點：興義市萬屯鎮(zhèn)云屯生態(tài)公園（WT）、安龍縣新橋鎮(zhèn)（XQ）、安龍縣海子鎮(zhèn)（HZ）、安龍縣平樂鎮(zhèn)（PL）、安龍縣龍廣鎮(zhèn)（LG）。每個地點選取黑柄乳菇成簇生長的菌塘，在距菌根2 cm半徑周圍處取土樣，混合后放入4 ℃冰箱保存。

1.1.2 藥品及試劑

Qubit3.0 DNA 檢測試劑盒，美國Life公司；E.Z.N.ATMMag-Bind Soil DNA Kit 試劑盒，美國OMEGA 公司；2×Taq Master Mix，南京諾唯贊生物技術公司；MagicPure Size Selection DNA Beads，北京全式金生物技術公司。

1.2 儀器和設備

Pico-21 臺式離心機，美國賽默飛公司；Bio-Rad PCR 擴增儀、凝膠成像儀，美國伯樂公司；Q32866 Qubit?3.0熒光計，美國英杰生物技術公司；DYCZ-21電泳槽、DYY-6C型電泳儀電源，北京市六一儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 樣品預處理

稱取200 mg土樣，放入滅菌的2 mL離心管中，加入1 mL PBS 緩沖液混勻，10 000 rpm 室溫離心3 min，棄上清，樣品干燥待用。

1.3.2 總DNA提取和檢測

按照OMEGA 試劑盒E.Z.N.ATM Mag-Bind Soil DNA Kit 使用說明操作提取總DNA，1%瓊脂糖凝膠檢測DNA完整性。

1.3.3 PCR擴增及測序

宏基因組測序類群為細菌；擴增區(qū)域為細菌V3～V4變區(qū)，引物1為341F:CCTACGGGNGGCWGCAG，引物2 為805R:GACTACHVGGGTATCTAATCC，測序平臺為Miseq，由生工生物工程(上海)公司完成。

1.3.4 數(shù)據(jù)分析

高通量測序序列（reads）通過拼接、過濾、去除嵌合體及非特異性擴增序列，進行OTU（Operational Taxonomic Unit）聚類分析和物種分類學分析。基于OTU 聚類分析結果，對OTU 進行多樣性指數(shù)分析、多樣性的群落組成分析，對系統(tǒng)發(fā)育信息進行Beta 多樣性分析、分組檢驗分析、差異顯著性檢驗、環(huán)境因子分析等深入的統(tǒng)計學和可視化擬合。

2 結果與分析

2.1 菌塘Alpha多樣性指數(shù)分析

表1 為各個菌塘土壤高通量測序數(shù)據(jù)Alpha 多樣性指數(shù)分析結果，可以反映所測微生物群落的豐度和多樣性。由表可知，五個菌塘土樣測序共得到140 903條有效序列，過濾后得到4 385 個有效OTU，樣品的Coverage 指數(shù)≥0.99，覆蓋率高，能真實反映樣品的測序情況。

表1 菌塘土壤中細菌Alpha多樣性指數(shù)分析

樣品的ACE 指數(shù)和Chao 指數(shù)反映群落分布豐度（Communit richness），數(shù)值越大說明樣本的菌群分布豐度越好；Shannoneven 指數(shù)越高或Simpson 指數(shù)越低，說明采樣點的菌群多樣性較豐富。從表1 可以看出，龍廣（LG）菌落較豐富、多樣性較好。

圖2為五個菌塘菌群樣品的稀釋曲線，Shannon指數(shù)先呈直線上升，后趨向平穩(wěn)，表明測序數(shù)據(jù)能較好地覆蓋菌塘中菌群的信息序列，曲線在平滑穩(wěn)定后產出的OTU 數(shù)趨于穩(wěn)定，其中來自海子（HZ）的樣品Shannon 指數(shù)稍低，說明該采集地的細菌多樣性低于其余四個菌塘。

圖2 五個菌塘中菌群的稀釋曲線

2.2 各樣品中細菌類群的相關性分析

圖3（參見封三）為五個菌塘菌群基于OTU 序列所作的聚類樹，可以看出HZ 和PL 聚成一類，并和LG、XQ 位于同一簇上，WT位于較遠分支，直觀反映了各個菌塘菌群的相似性和差異關系。

圖3 樣品OUT數(shù)的聚 類樹

圖4（參見封三）的韋恩圖為各個菌塘菌群間OTU 關聯(lián)分析，反映了各自生境中土壤菌群的復雜性和共性。五個菌塘共有的OTU 數(shù)是471 個，各個菌塘菌群互有重疊，反映的是菌塘間的共性；不重疊部分除了萬屯（WT）較多，有104個OTU外，其余菌塘均較少。除了萬屯（WT）位于生態(tài)公園內，人類活動影響較小之外，其余四個采集地都在安龍縣農業(yè)生產區(qū)。數(shù)據(jù)分析結果直觀反映出各菌塘土壤基質微生物種類相似性和差異性。

圖4 各個菌塘菌群多樣性的關聯(lián)分析

2.3 菌塘中細菌組成分析

五個菌塘細菌菌群歸屬于9 個門，即變形菌門（Proteobacteria，68.88%～43.97%）、酸桿菌門（Acidobacteria，30.24%～10.33%）、放線菌門（Actinobacteria，15.70%～4.78%）、浮霉菌門（Planctomycetes）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、疣微菌門（Verrucomicrobia）、candidate_division_WPS-1、綠彎菌門（Chloroflexi）和candidate_division_WPS-2，從圖5（參見封三）中可知，以變形菌門、酸桿菌門和放線菌門為主。

圖5 不同菌塘門水平分類豐度統(tǒng)計

由圖6（參見封三）可見，各菌塘在屬級水平上比較豐度，有27個屬，平樂（PL）菌塘主要的屬有緩生根瘤菌屬（Bradyrhizobium，7.52%）、伯克氏菌屬（Burkholderia，5.89%）、Gp1（7.02%）；萬 屯（WT）菌塘主要的屬有緩生根瘤菌屬（Bradyrhizobium，6.35%）、根瘤菌屬（Rhizobium，5.6%）、假單胞菌屬（Pseudomonas，5.55%）；新橋（XQ）菌塘主要的屬有伯克氏菌屬（Burkholderia，9.53%）、假單胞菌屬（Pseudomonas，5.67%）、Gp1（4.39%）；海子（HZ）菌塘主要的屬有Gp1（10.24%）、Gp2（9.5%）、慢生根瘤菌屬（Bradyrhizobium，8.86%）、伯克氏菌屬（Burkholderia，6.54%）；龍廣（LG）菌塘主要的屬有緩生根瘤菌屬（Bradyrhizobium，6.51%）、Gp2（4.72%）、Gp1（4.16%）。

圖6 不同菌塘屬水平分類豐度統(tǒng)計

結合各個菌塘門、屬水平統(tǒng)計及表2 所列前幾種優(yōu)勢屬可知，各個菌塘中的優(yōu)勢菌門和屬均是變形菌門及其下屬，這些菌群能起到固氮及吸收轉化磷、鉀等無機鹽的作用，并與黑柄乳菇菌絲、土壤腐殖質等扭結形成菌根菌共生體，外部表現(xiàn)為根瘤形態(tài)。同時注意到各個菌塘的酸桿菌門及酸桿菌屬Gp1、Gp2 和Gp3 含量較高，通常認為這些菌增多可對被污染土壤進行修復。

表2 五個樣品中的優(yōu)勢細菌屬及其相對豐度

3 結論

采用高通量測序技術結合生物信息學對黔西南州的野生黑柄乳菇五個菌塘進行分析，對菌群的組成和豐度形成了一個規(guī)律性的認識。各個菌塘中以變形菌門、酸桿菌門、放線菌門為主，菌群的組成類型變化不大但豐度上有區(qū)別，例如萬屯（WT）菌塘變形菌門豐度達到68.88%，龍廣（LG）菌塘變形菌門豐度為43.97%；海子（HZ）菌塘酸桿菌門豐度為30.24%，萬屯（WT）菌塘酸桿菌門豐度為10.33%。采樣點萬屯鎮(zhèn)云屯生態(tài)公園環(huán)境保護相對較好，土壤有機質豐富，黑柄乳菇生活的菌塘中以固氮和轉化磷、鉀元素為主的變形菌門居多[18-19]；海子鎮(zhèn)是安龍縣糧食主產區(qū)，自然環(huán)境受人類生產活動影響較大，與萬屯相比酸桿菌門豐度較高（通常認為在人類生產活動較多的環(huán)境，例如過度施肥、噴施農藥等會引起土壤中酸桿菌屬含量升高）。酸桿菌門的Gp1、Gp2、Gp3能降低土壤中的重金屬和農藥污染[20]，有助于恢復土壤生態(tài)。

乳菇作為貴州食用菌“黔菌”品牌重點打造的項目之一，其中的松乳菇已有少量人工栽培，但遠不能滿足市場需要。興義野生黑柄乳菇在當?shù)爻霎a豐富，味道鮮美，深受消費者喜愛，市場價格也在逐年攀升。對黑柄乳菇的菌塘菌群組成和豐度開展研究，進行深入了解，對下一步做“精”、做“特”食用菌產業(yè)具有理論指導意義。通過本次分析，發(fā)現(xiàn)生境中的酸桿菌門菌群較豐富，說明人類在野生菌產出區(qū)域活動過于頻繁，對土壤的理化性質已造成影響，提醒我們注意保護當?shù)厣鷳B(tài)環(huán)境，保護野生黑柄乳菇及其他野生食用菌的可持續(xù)生長和出產品質。