新型冠狀病毒輔助蛋白ORF3a、ORF3b的致病機制研究

高文欣, 李希琳, 傅煜軒

(蘇州大學生物醫學研究院, 江蘇 蘇州, 215000)

作為一種新發傳染病病原體，新型冠狀病毒(SARS-CoV-2)全球大流行在世界范圍內造成了巨大的健康危機和無以估量的損失，故亟需針對病毒的致病機制進行詳細闡述和研究[1]。SARS-CoV-2為正股單鏈RNA病毒，基因組長約30 kb, 包含多達8個非結構基因(ORF3a、ORF3b、ORF6、ORF7a、ORF7b、ORF8a、ORF8b和ORF9)[2-3]。ORF3作為冠狀病毒特有的重要非結構基因，可編碼翻譯2種輔助蛋白，即ORF3a和ORF3b。相關研究[4]表明，冠狀病毒輔助蛋白ORF3a、ORF3b廣泛參與宿主免疫調控，在病毒的致病性中發揮著重要作用，且能夠反映病毒毒力，還是病毒RNA復制、組裝以及釋放所必需的。不同冠狀病毒ORF3a、ORF3b基因序列保守性較差，易突變或缺失[5]。目前, SARS-CoV-2輔助蛋白ORF3a、ORF3b的功能尚不明確，本研究探討了特異性輔助蛋白ORF3a、ORF3b對SARS-CoV-2致病性的影響，以期為深入理解其致病機制并提出針對性防控策略奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

人肺細胞系A549細胞和人腎上皮細胞系293T細胞購自美國ATCC細胞庫; ploy(I∶C)購自美國Sigma公司; RIPA裂解液、Lipofectamine 3000、SYBR Green Master Mix試劑均購自美國Life Technologies公司; 二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量試劑盒購自美國Thermo公司; 多聚甲醛、TritonX-100化學試劑購自南京化學試劑股份有限公司; MyD88、TRAF6和GAPDH一抗均購自美國CST公司; pFLAG-NC、pFLAG-ORF3a、pFLAG-ORF3b表達載體和S、M、E及N表達載體購自美國Addgene公司; PrimeScript RT Master Mix逆轉錄試劑盒購自大連TaKaRa公司; ABI-7500實時定量聚合酶鏈式反應儀(美國Applied Biosystems公司); Olympus FluoView FV10i熒光顯微鏡(日本Olympus公司)。

1.2 總RNA提取及炎癥因子檢測

將A549細胞鋪板，密度為60%～80%, 對A549細胞予以ploy(I∶C)刺激并通過Lipofectamine 3000轉染ORF3a或ORF3b表達載體，設置2組分別轉染ORF3a表達載體(pFLAG-ORF3a組)、ORF3b表達載體(pFLAG-ORF3b組)，并設置未處理組(Mock組)和單純ploy(I∶C)刺激組(control組)。24 h后通過Trizol試劑對各組細胞進行總RNA提取，使用PrimeScript RT Master Mix逆轉錄試劑盒進行逆轉錄，以GAPDH為內參，使用SYBR Green Master Mix試劑通過ABI-7500實時定量聚合酶鏈式反應儀進行實時熒光定量聚合酶鏈式反應(qRT-PCR)。設置40個循環反應，以所得Ct平均值計算基因表達量。引物序列: β干擾素(IFN-β)正向引物5′-TAGCACTGGCTGGAATGAG-3′, 反向引物5′-GTTTCGGAGGTAACCTGTAAG-3′; 腫瘤壞死因子-α(TNF-α)正向引物5′-CCCAGGGACCTCTCTCTAATCA-3′, 反向引物5′-GCTACAGGCTTGTCACTCGG-3′; 白細胞介素-1β(IL-1β)正向引物5′-AATCTGTACCTGTCCTGCGTGTT-3′, 反向引物5′-TGGGTAATTTTTGGGATCTACACTCT-3′; 白細胞介素-6(IL-6)正向引物5′-AGTGCCTCTTTGCTGCTTTCAC-3′, 反向引物5′-TGACAAACAAATTCGGTACATCCT-3′;GAPDH正向引物5′-TGCACCACCAACTGCTTAGC-3′, 反向引物5′-GGCATGGACTGTGGTCATGAG-3′。

1.3 蛋白質印跡法(Western blot)檢測蛋白表達

將密度為60%～80%的A549細胞鋪板，給予IFN-β刺激后，應用Lipofectamine 3000轉染ORF3a或ORF3b表達載體，分別設置為IFN-β+pFLAG-ORF3a組[IFN-β(+)、pFLAG-ORF3a(+)、pFLAG-ORF3b(-)]、IFN-β+pFLAG-ORF3b組[IFN-β(+)、pFLAG-ORF3a(-)、pFLAG-ORF3b(+)], 并設置未處理組[IFN-β(-)、pFLAG-ORF3a(-)、pFLAG-ORF3a(-)]和IFN-β刺激組[IFN-β(+)、pFLAG-ORF3a(-)、pFLAG-ORF3a(-)], 24 h后，加入RIPA裂解液冰上裂解15 min, 以12 000 g離心10 min, 取上清液轉移至新的離心管，通過BCA法檢測蛋白濃度后，將1×上樣緩沖液和蛋白混合, 98 ℃煮5 min, 進行上樣電泳，每個樣本上樣量總蛋白為50 μg。轉膜、封閉2 h后，給予MyD88、TRAF6和GAPDH一抗4 ℃孵育過夜，以TBST緩沖液洗滌3次后，加二抗室溫孵育60 min, 用TBST緩沖液洗滌3次后進行曝光。

1.4 SARS-CoV-2假病毒顆粒收集及感染

用S、M、E、N表達載體轉染293T細胞(轉染比例為8∶6∶8∶3), 設置2組分別轉染ORF3a表達載體(pFLAG-ORF3a組)、ORF3b表達載體(pFLAG-ORF3b組)，并設置未轉染組(Mock組)和空載轉染組(pFLAG-NC組)。72 h后，收集細胞上清液，以10 000 g離心30 min去除細胞碎片，再以120 000 g超速離心3 h, 收集病毒顆粒沉淀，通過無血清培養基懸浮后，將收集到的4組SARS-CoV-2假病毒顆粒加入過表達血管緊張素轉化酶2(ACE2)的A549細胞(A549-ACE2)中, 24 h后，細胞以4%多聚甲醛固定，使用磷酸鹽緩沖液(PBS)輕洗，通過倒置熒光顯微鏡觀察并采集圖像，統計各組被SARS-CoV-2假病毒感染的細胞(GFP陽性細胞)占比。

1.5 統計學分析

使用GraphPad軟件8.0進行圖形表示和統計分析，所有結果均顯示為3次獨立實驗的平均值±標準差，不同處理組之間的差異采用t檢驗或單因素方差分析(one-way ANOVA)進行分析，雙側檢驗P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 ORF3a、ORF3b對SARS-CoV-2假病毒顆粒組裝與釋放的影響

將各組SARS-CoV-2假病毒顆粒加入A549-ACE2中, 24 h后通過熒光顯微鏡觀察并統計，結果顯示, pFLAG-ORF3a組、pFLAG-ORF3b組細胞組裝和釋放出的SARS-CoV-2假病毒顆粒量均高于Mock組和pFLAG-NC組，差異有統計學意義(P<0.001), 見圖1。由此表明, ORF3a、ORF3b可促進SARS-CoV-2假病毒顆粒的組裝與釋放。

A: 各組A549-ACE2細胞經SARS-CoV-2假病毒感染的熒光顯微鏡下觀察結果(放大100倍); B: 各組GFP陽性細胞情況比較(與Mock組、pFLAG-NC組比較, ***P<0.001)。圖1 SARS-CoV-2假病毒感染A549-ACE2細胞的熒光顯微鏡下觀察與統計

2.2 ORF3a、ORF3b對宿主細胞干擾素應答的影響

給予A549細胞ploy(I∶C)刺激以誘導干擾素應答，并轉染ORF3a或ORF3b表達載體, 24 h后檢測各組IFN-β表達水平。qRT-PCR檢測結果顯示, control組IFN-β相對表達量高于Mock組，而pFLAG-ORF3a組、pFLAG-ORF3b組IFN-β相對表達量低于control組，差異均有統計學意義(P<0.001), 說明ORF3a、ORF3b表達均可顯著抑制ploy(I∶C)所誘導的IFN-β表達水平，見圖2A。Western blot檢測結果顯示, IFN-β刺激組MyD88、TRAF6蛋白表達量高于未處理組，而IFN-β+pFLAG-ORF3a組、IFN-β+pFLAG-ORF3b組MyD88、TRAF6蛋白表達量低于IFN-β刺激組，差異均有統計學意義(P<0.001), 見圖2B, 提示ORF3a、ORF3b表達均能抑制干擾素信號通路中關鍵蛋白MyD88、TRAF6的表達水平，進而抑制干擾素應答。

A: 各組細胞IFN-β相對表達量比較(組間比較, ***P<0.001); B: 各組干擾素信號通路蛋白表達量的Western blot檢測結果。圖2 ORF3a、ORF3b對宿主細胞干擾素應答的影響

2.3 ORF3a、ORF3b對宿主細胞炎癥應答的影響

采用qRT-PCR法檢測A549細胞轉染ORF3a或ORF3b表達載體后的炎癥因子表達情況，結果顯示, pFLAG-ORF3a組、pFLAG-ORF3b組炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6相對表達量均高于pFLAG-NC組，差異有統計學意義(P<0.01或P<0.001), 見圖3，說明ORF3a和ORF3b可誘導宿主細胞炎癥因子的表達。

A: 各組細胞TNF-α相對表達量比較; B: 各組細胞IL-1β相對表達量比較; C: 各組細胞IL-6相對表達量比較。與pFLAG-NC組比較, **P<0.01, ***P<0.001。圖3 ORF3a、ORF3b對宿主細胞炎癥應答的影響

3 討 論

SARS-CoV-2目前仍處于全球大流行狀態，嚴重威脅著人類的健康與生活，但SARS-CoV-2的致病性尚未闡明，故亟需深入研究以控制疫情傳播態勢[6-7]。ORFs是一類零散分布在結構基因之間或內部的編碼39～274個氨基酸的特異性蛋白，保守性較差，易突變[3-4]。這些ORFs蛋白對病毒的復制、致病性或免疫調控發揮著重要作用，包括促進炎癥產生、抑制Ⅰ型干擾素產生以及誘導細胞凋亡等[8-9]。相關研究[10]指出, ORF8a或ORF8b通過泛素化酶體途徑介導干擾素調節因子3(IRF3)降解，抑制Ⅰ型干擾素的產生，協助嚴重急性呼吸系統綜合征冠狀病毒(SARS-CoV)逃避宿主的免疫防御。另有報道[11]發現，有些ORFs蛋白是冠狀病毒的重要毒力因子及致病因子，具有較好的免疫原性，例如SARS-CoV的ORF3b蛋白能夠刺激機體產生相應的特異性抗體，具備良好的免疫原性。

SARS-CoV-2理論上至少能夠編碼翻譯7個特異性非結構蛋白(ORF3a、ORF3b、ORF6、ORF7a、ORF 7b、ORF8和ORF10)。雖然SARS-CoV-2和SARS-CoV的病毒基因組序列相近，兩者生活周期及其所引發疾病的臨床表現也類似，但對比分析氨基酸序列可發現, SARS-CoV-2與SARS-CoV最主要的差異性序列表現在S蛋白(76%)和非結構蛋白ORF3(72%)、ORF8(40%)中[8-9]。ORF3作為冠狀病毒特有的重要非結構蛋白，在病毒生活周期和致病性方面至關重要。ORF3a包含6個功能域(Ⅰ～Ⅵ), 這6個功能域分別與病毒毒力、感染性、離子通道形成和病毒釋放緊密相關，但SARS-CoV-2的ORF3a的6個功能域在氨基酸序列上均與SARS-CoV的ORF3a具有差異性[12], 且SARS-CoV-2的ORF3b蛋白只有22個氨基酸，遠少于SARS-CoV的ORF3b蛋白的154個氨基酸[13-14], 提示SARS-CoV-2編碼翻譯的ORF3a、ORF3b蛋白的功能可能與SARS-CoV并不同。此外，感染SARS-CoV-2后的Vero細胞中，除了結構基因蛋白(N、S、M)外, ORF3a是胞內最豐富的表達轉錄本之一，而ORF10可能并不表達[2], 進一步提示ORF3蛋白在SARS-CoV-2生活周期及致病過程中扮演著重要角色。

本研究聚焦于SARS-CoV-2特異性非結構蛋白ORF3a、ORF3b在調控病毒組裝、釋放以及干擾素、炎癥應答過程中的作用。SARS-CoV-2假病毒組裝和釋放檢測結果顯示, ORF3a和ORF3b可促進SARS-CoV-2假病毒顆粒的組裝和釋放，提示ORF3a和ORF3b在輔助病毒顆粒組裝和釋放等過程中扮演著重要角色，其活性可能與宿主中的病毒載量有關。干擾素表達是宿主抵抗病毒等微生物感染最重要的抗感染應答之一，本研究發現, ORF3a、ORF3b表達可顯著抑制ploy(I∶C)誘導的IFN-β表達水平，進一步證明干擾素應答的減弱是通過抑制干擾素信號通路中關鍵蛋白MyD88、TRAF6表達水平來實現的，提示ORF3a和ORF3b的表達能夠為病毒提供有利的復制和組裝環境，使得病毒更高效地復制和組裝，并拮抗宿主抗病毒反應。本研究還發現, ORF3a或ORF3b的表達可誘導炎癥因子TNF-α、IL-1β和IL-6表達，說明ORF3a、ORF3b可誘導宿主細胞炎癥因子表達，提示宿主機體的炎癥損傷可能與病毒的ORF3a、ORF3b表達有關。

綜上所述，非結構蛋白ORF3a、ORF3b能夠促進SARS-CoV-2組裝、釋放，誘導宿主炎癥應答，并抑制宿主干擾素表達。本研究為更好地了解病毒編碼翻譯產生的特異性非結構蛋白在SARS-CoV-2致病性中的作用提供了新的見解，也為新型冠狀病毒肺炎致病機制的深入研究和針對性藥物的研發等提供了新的依據，同時能夠為設計改造減毒病毒株或無毒病毒株提供理論基礎，并為深入理解病毒誘導宿主固有免疫應答與炎癥因子風暴的機制和遏制SARS-CoV-2的傳播與致病性提供創新性科學理論。