二氫楊梅素及其酰化衍生物對肝細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用

杜寶雙 陳尚衛(wèi) 李 玥 朱 松

(1. 江南大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無錫 214122；2. 江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇 無錫 214122)

大部分的肝損傷疾病如肝硬化、肝纖維化等，都伴隨著由細(xì)胞氧化應(yīng)激以及脂質(zhì)過氧化[1]引起的肝細(xì)胞氧化損傷。

二氫楊梅素(DHM)是一種苷元類類黃酮化合物，主要來源于藥食同源植物顯齒蛇葡萄[2]，具有抗菌、抗氧化、抗炎、護(hù)肝、調(diào)節(jié)糖代謝等生物功能[3-4]。有研究發(fā)現(xiàn)二氫楊梅素可以通過調(diào)節(jié)抗氧化指標(biāo)和抗炎因子抑制氧化應(yīng)激從而減輕小鼠肝臟氧化損傷[5]，且在油酸誘導(dǎo)的L02細(xì)胞和HepG2細(xì)胞肝脂肪變性模型中，二氫楊梅素具有抑制細(xì)胞凋亡、脂質(zhì)積累和氧化應(yīng)激的作用[6]。但由于二氫楊梅素親脂性差，在生物體系中不易透過脂質(zhì)雙分子層，使其轉(zhuǎn)運(yùn)吸收緩慢，限制了其在肝臟中的利用。

目前，可以通過酰化修飾提高DHM的脂溶性，即選擇合適的酰基供體取代二氫楊梅素分子上對其活性影響較小的羥基基團(tuán)，進(jìn)而降低其極性[7]。其中，酶法酰化是常用的酰化方法，該方法綠色環(huán)保、過程簡單且選擇性高[8]。因此研究擬建立人正常肝細(xì)胞氧化損傷模型，通過酶法酰化修飾DHM得到不同親脂性的DHM衍生物，考察DHM及其衍生物對肝細(xì)胞氧化損傷模型的保護(hù)機(jī)制，以期為二氫楊梅素應(yīng)用于生物體系提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

二氫楊梅素、槲皮素：純度>98%，合肥博美生物科技有限公司；

固定化脂肪酶(Lipozyme TL IM)：250 U/g，諾維信生物技術(shù)有限公司；

丁酸乙烯酯、己酸乙烯酯、辛酸乙烯酯和己酸乙烯酯：東京化成工業(yè)株式會(huì)社；

30%過氧化氫(H2O2)、甲基叔丁基醚：分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；

PMSF蛋白酶抑制劑、ROS試劑盒、線粒體膜電位檢測試劑盒、RIPA細(xì)胞裂解液、Caspase 3活性檢測試劑盒：上海碧云天生物技術(shù)有限公司；

胎牛血清(FBS)、青霉素—鏈霉素雙抗(100×)、磷酸緩沖液(PBS)：Themo Fisher Scientific公司；

MTT試劑盒、LDH檢測試劑盒、BCA試劑盒、MDA檢測試劑盒、總SOD活性檢測試劑盒、CAT檢測試劑盒、GSH-PX檢測試劑盒：南京建成生物工程研究所。

1.2 儀器與設(shè)備

倒置熒光顯微鏡：ECLISE Ti2型，美國尼康公司；

高速冷凍離心機(jī)：Centrifuge 5415R型，德國艾本德公司；

雪花制冰機(jī)：FMB40型，無錫沃信有限公司；

全波長酶標(biāo)儀：Multiskan GO1510型，賽默飛科技有限公司；

磁力攪拌器：RET型，IKA公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 DHM衍生物制備 在反應(yīng)瓶中依次加入10 mL甲基叔丁基醚，0.18 mmol DHM和0.4 U/mg DHM的固定化脂肪酶，再分別加入3.6 mmol不同碳鏈的脂肪酸乙烯酯，上述反應(yīng)體系在50 ℃、200 r/min下反應(yīng)72 h。然后分離純化樣品，冷凍干燥后得到5種3-O-酰化二氫楊梅素，分別為3-O-乙酰化二氫楊梅素(C2-DHM)、3-O-丁酰化二氫楊梅素(C4-DHM)、3-O-己酰化二氫楊梅素(C6-DHM)、3-O-辛酰化二氫楊梅素(C8-DHM)和3-O-月桂酰化二氫楊梅素(C12-DHM)。

1.3.2 H2O2損傷濃度確定 在96孔板中培養(yǎng)(7×103個(gè)/孔，100 μL)24 h，將細(xì)胞分成2組，一組加入100 μL 不完全培養(yǎng)基(含1%雙抗但不含F(xiàn)BS)，另一組加入100 μL含H2O2(200，300，400，500，600 μmol/L)的培養(yǎng)基。孵育4 h后，按照MTT試劑盒說明書檢測細(xì)胞增殖情況。選擇細(xì)胞存活率在50%左右的H2O2濃度構(gòu)建肝細(xì)胞氧化損傷模型。

1.3.3 肝細(xì)胞氧化損傷模型建立 將L02細(xì)胞分為損傷組、保護(hù)組和對照組，置于96孔板中培養(yǎng)(1×104個(gè)/孔，100 μL) 24 h。隨后往保護(hù)組加入100 μL含DHM或DHM衍生物(3.25，7.50，15.00，30.00 μmol/L)的培養(yǎng)基，對照組和損傷組中加入100 μL不完全培養(yǎng)基，孵育24 h。孵育結(jié)束后，保護(hù)組和損傷組中均加入100 μL含適宜損傷濃度H2O2的培養(yǎng)基，對照組中加入同等體積的不完全培養(yǎng)基，孵育4 h，按照MTT試劑盒說明書檢測各組細(xì)胞增值情況。選擇細(xì)胞存活率最高的樣品濃度作為最佳保護(hù)濃度。同時(shí)，選擇槲皮素做為陽性對照。

1.3.4 DHM及其衍生物對細(xì)胞內(nèi)氧化損傷相關(guān)理化指標(biāo)的影響

(1) ROS、LDH、MDA、CAT、MDA、SOD和GSH-PX：在6孔板中培養(yǎng)L02細(xì)胞(3×105個(gè)/孔，2 mL) 24 h，保護(hù)組中加入2 mL含最佳濃度樣品的培養(yǎng)基，對照組和損傷組加入同等體積的不完全培養(yǎng)基，孵育24 h后，損傷組和保護(hù)組加入2 mL含H2O2(400 μmol/L)的培養(yǎng)基，對照組加入同等體積的不完全培養(yǎng)基，再孵育4 h 后吸去上清，PBS清洗兩遍。按照相應(yīng)的試劑盒說明書檢測培養(yǎng)基中ROS、LDH、MDA、CAT、MDA、SOD和GSH-PX水平，用倒置熒光顯微鏡拍照。

(2) 線粒體膜電位：在6孔板中培養(yǎng)L02細(xì)胞(3×105個(gè)/孔，2 mL) 24 h，保護(hù)組中加入2 mL含最佳濃度樣品的培養(yǎng)基，損傷組和對照組中加入同等體積的不完全培養(yǎng)基，繼續(xù)孵育24 h后，保護(hù)組和損傷組中加入2 mL 含損傷濃度適宜的H2O2培養(yǎng)基，對照組中加入同等體積的不完全培養(yǎng)基，再孵育4 h后，加入含有1% PMSF的RIPA裂解液處理30 min，用移液槍吸取裂解液至離心管中，離心(15 000 r/min)得上清液。按照線粒體膜電位試劑盒說明書進(jìn)行檢測，使用熒光倒置顯微鏡進(jìn)行拍照。

(3) Caspase 3：試驗(yàn)步驟參照1.2.4，并按試劑盒說明書測定Caspase 3相對活性水平。

1.3.5 數(shù)據(jù)分析 使用Microsoft Excel和Origin 2018處理數(shù)據(jù)和繪圖，并使用IBM SPSS Statistics 22進(jìn)行顯著性分析(P<0.05)，所有試驗(yàn)均重復(fù)3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 過氧化氫損傷濃度

由圖1可知，在200～600 μmol/L的濃度范圍內(nèi)，相同的孵育時(shí)間下，隨著H2O2濃度的增大，細(xì)胞存活率逐漸下降。一般情況下，選擇細(xì)胞存活率在50%左右的濃度或者孵育時(shí)間構(gòu)建細(xì)胞氧化損傷模型[9]，因此，選擇濃度400 μmol/L的H2O2建模，在此濃度下孵育4 h細(xì)胞存活率約為45%。

小寫字母不同表示差異顯著(P<0.05)

2.2 DHM及其衍生物濃度對氧化損傷肝細(xì)胞的保護(hù)作用

由圖2可知，在3.25,7.50 μmol/L濃度下，DHM及其衍生物處理組的細(xì)胞存活率均低于槲皮素處理組；而在15,30 μmol/L濃度下，C8-DHM處理組的細(xì)胞存活率高于槲皮素處理組，而其他衍生物包括DHM處理組的細(xì)胞存活率低于槲皮素處理組，這表明，在此濃度下，C8-DHM對肝細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)效果高于槲皮素。在3.25～30.00 μmol/L的濃度范圍內(nèi)，DHM及其衍生物處理組的細(xì)胞存活率均高于損傷組，且隨著濃度的增大，DHM和C2-DHM處理組的細(xì)胞存活率逐漸升高；其他衍生物處理組的細(xì)胞存活率則先升高后降低。在15 μmol/L時(shí)各組的細(xì)胞存活率最高，其中C8-DHM處理組的細(xì)胞存活率最高，達(dá)到了88.81%，即C8-DHM對細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)效果最為明顯。隨著親脂性的提高，DHM衍生物更容易與細(xì)胞膜結(jié)合并穿過細(xì)胞膜，進(jìn)而參與到細(xì)胞內(nèi)的自由基產(chǎn)生的反應(yīng)過程中發(fā)揮活性，起到保護(hù)肝細(xì)胞、提高細(xì)胞活力的作用；而當(dāng)取代碳鏈達(dá)到一定長度后，空間位阻增大，阻礙衍生物進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部且限制其與自由基的接觸，從而影響了活性的發(fā)揮。

圖2 DHM及其衍生物對L02細(xì)胞氧化損傷模型的保護(hù)作用

2.3 DHM及其衍生物對細(xì)胞內(nèi)ROS水平的影響

采用DCFH-DA熒光探針法檢測ROS水平，以DCF熒光圖像中綠色強(qiáng)弱作為評判。熒光圖像中綠色熒光強(qiáng)度越弱表示ROS水平越低，反之則表示ROS水平越高[10]。熒光結(jié)果為對照組的圖像中幾乎無綠色熒光，而H2O2損傷組的綠色熒光強(qiáng)度明顯增強(qiáng)，可見損傷組的細(xì)胞被H2O2刺激后產(chǎn)生并累積了過量的ROS；相較于損傷組，DHM及其衍生物處理組的熒光強(qiáng)度明顯減弱，表明DHM及其衍生物均能抑制細(xì)胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生。當(dāng)取代碳鏈長度從C0增加到C8時(shí)，細(xì)胞內(nèi)的熒光強(qiáng)度越來越弱，ROS水平逐漸降低；取代碳鏈長度從C8增加到C12時(shí)，細(xì)胞內(nèi)的熒光強(qiáng)度稍有增強(qiáng)，ROS水平提高。

2.4 DHM及其衍生物對細(xì)胞LDH釋放的影響

由圖3可知，與損傷組相比，DHM及其衍生物處理組細(xì)胞培養(yǎng)液中的LDH水平明顯下降(P<0.05)，且隨著取代碳鏈長度的增長，細(xì)胞胞外LDH的活性呈先降低后升高的趨勢，其中，C8-DHM處理組細(xì)胞培養(yǎng)液中LDH的活性最低，降到了384.56 U/L。綜上，DHM及其衍生物可以通過保護(hù)細(xì)胞膜以提高細(xì)胞活力，其中，C8-DHM的效果最好。

小寫字母不同表示差異顯著(P<0.05)

2.5 DHM及其衍生物對MDA水平的影響

由圖4可知，與損傷組相比，DHM及其衍生物處理組的MDA水平顯著降低(P<0.05)，除C2-DHM處理組外，其余衍生物處理組的MDA水平均低于DHM處理組，可見，親脂性的提高可以使DHM更容易進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)阻止過氧化反應(yīng)的發(fā)生，從而避免細(xì)胞的損傷，其中C6-DHM和C8-DHM的效果最好。

小寫字母不同表示差異顯著(P<0.05)

2.6 DHM及其衍生物對細(xì)胞中抗氧化酶系的影響

由圖5可知，相較于H2O2損傷組，DHM及其衍生物處理組的SOD、GSH-PX和CAT活力均有所提高；衍生物處理組中，除C12-DHM外，其余衍生處理組的3種抗氧化酶的活力均高于DHM處理組。總體上看，隨著取代碳鏈的延長，3種抗氧化酶的活力呈先升高后降低的趨勢，C8-DHM對3種抗氧化酶活力的提高效果最為明顯。因此，DHM及其衍生物對細(xì)胞內(nèi)ROS的清除能力與細(xì)胞內(nèi)的抗氧化酶系有關(guān)，而親脂性一定程度的提高有利于DHM進(jìn)入細(xì)胞上調(diào)相關(guān)的抗氧化酶活力。

小寫字母不同表示差異顯著(P<0.05)

2.7 DHM及其衍生物對線粒體膜電位的影響

通過JC-1熒光探針檢測的紅綠熒光變化可評估線粒體膜電位的下降程度。由熒光結(jié)果可知，相比于對照組，損傷組基本上整體呈現(xiàn)綠色熒光，表明其線粒體膜電位顯著降低；相較于損傷組，DHM及其衍生物組的紅色熒光程度增強(qiáng)，而且衍生物處理組的紅色熒光程度高于DHM處理組，表明DHM及其衍生物能夠抑制線粒體膜電位的下降，且衍生物組的細(xì)胞線粒體膜電位高于DHM處理組，其中，經(jīng)C8-DHM處理的細(xì)胞圖像中幾乎無綠色熒光，表明其能顯著抑制線粒體膜電位的下降，從而阻止早期的細(xì)胞凋亡。

2.8 DHM及其衍生物對Caspase 3水平的影響

由圖6可知，Caspase活性相對水平依次為對照組≈DHM處理組>C2-DHM處理組>C12-DHM處理組>C4-DHM處理組>C6-DHM處理組≈C8-DHM處理組>空白組，5種衍生物處理組的Caspase 3相對活性水平顯著低于DHM處理組，其中C6-DHM和C8-DHM處理組的Caspase 3相對活性水平最低，表明中等鏈長的親脂性衍生物可顯著增強(qiáng)DHM抑制Caspase 3活性的能力。

小寫字母不同表示差異顯著(P<0.05)

3 結(jié)論

通過構(gòu)建L02細(xì)胞過氧化氫損傷模型，考察了二氫楊梅素及其衍生物對肝細(xì)胞損傷的保護(hù)效果。除3-O-月桂酰化二氫楊梅素(C12-DHM)外，其余衍生物處理組對L02細(xì)胞的保護(hù)作用均高于DHM，DHM衍生物能通過調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的抗氧化通路減少活性氧的產(chǎn)生和積累，其中3-O-辛酰化二氫楊梅素(C8-DHM)對L02細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)效果最為顯著。關(guān)于二氫楊梅素及其衍生物對細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用機(jī)制只探討了線粒體通路中的關(guān)鍵位點(diǎn)，接下來會(huì)進(jìn)一步考察對其他通路如內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通路、死亡受體通路等的影響。