基于脫氧核酶的食品安全快速檢測方法研究進展

曾 瑜 諶委菊 全 珂 雷艷麗

(1. 長沙理工大學食品與生物工程學院，湖南 長沙 410114；2. 細胞化學湖南省重點實驗室，湖南 長沙 410114)

食品在加工、運輸、貯存等過程中易引入有害物質，如重金屬、病源微生物、非法添加劑等，使得食品質量與安全面臨嚴峻考驗[1]。近年來，隨著食品安全事件的頻繁爆發，食品安全已發展成為危害人體健康的全球性問題。全球每年約6億人口因食用被污染的食物而生病，其中42萬人口因此喪生[2]。傳統的食源性有害物質分析方法包括高效液相色譜法[3]、液質聯用法[4]、聚合酶鏈式反應[5]、免疫分析法[6]等，具有良好的準確性和靈敏度，但是存在儀器昂貴、樣品前處理過程復雜且對操作者專業素養要求高等不足，難以實現食物樣品的現場快速檢測。因此，發展高效、簡便的食源性有害物傳感技術已成為當前食品安全領域關注的焦點。

脫氧核酶(DNAzyme)是一類經指數富集的配基系統進化篩選技術獲得的，具有高特異性底物識別能力和高效催化能力的單鏈DNA分子[7]。Breaker等[8]發現短的單鏈DNA可以催化RNA磷酸二酯鍵水解斷裂，并提出了脫氧核酶的概念。脫氧核酶的發現打破了人們對DNA是一種結構、功能單一的惰性分子的認知。隨后一系列具有不同催化活性的脫氧核酶被相繼發現，如介導核酸連接、磷酸化等[9]。與傳統的蛋白質酶相比，脫氧核酶具有以下優勢：① 性質穩定，在高溫、極度酸堿環境下發生變性后可復性，且復性前后催化活性基本沒有變化，便于存儲與運輸；② 易化學合成與修飾，合成成本低且批次差異小；③ 依賴特定輔因子激活催化活性，輔因子種類豐富，涉及金屬離子、小分子、氨基酸、蛋白質、致病微生物等；④ 結構柔軟，可設計性強，如能對其進行劈裂處理或改變其催化構象；⑤ 基于其核酸本質，能夠與滾環擴增(RCA)[10]、雜交鏈式反應(HCR)[11]等核酸等溫擴增技術完美結合，在不借助特定儀器設備的情況下對檢測信號進行放大。因此，基于上述優點，脫氧核酶為開發高靈敏、高效的臨場檢測方法提供了理想的分子工具，近年來在食品安全檢測領域得到了廣泛應用。

研究擬綜述基于脫氧核酶的食品安全快速檢測方法的研究進展，以期為食品有害物的現場檢測提供借鑒。

1 脫氧核酶的結構與活性

1.1 具有RNA切割活性的脫氧核酶

根據催化功能的不同，當前脫氧核酶大體可以分為5類：① 具有核酸切割活性的脫氧核酶[12]；② 具有核酸連接活性的脫氧核酶[13]；③ 具有DNA激酶活性的脫氧核酶[14]；④ 具有DNA戴帽活性的脫氧核酶[15]；⑤ 具有過氧化物酶活性的脫氧核酶[16]。其中，具有RNA切割活性的脫氧核酶應用最為廣泛。該類核酶由催化功能域和位于兩側的結合臂組成，其可通過結合臂與底物序列進行堿基互補配對進而發生特異性結合，在金屬離子或生物分子等輔因子作用下，誘導催化功能域折疊形成特定的二級結構，隨后催化底物序列中RNA堿基上的2′-OH位置發生酯交換反應，最終將底物鏈裂解成兩段[17-18]。

以篩選過程中第10輪循環中的第23個克隆(10-23)和第8輪循環中的第17個克隆(8-17)2種研究最為深入的脫氧核酶為例，兩者的輔因子均為Mg2+，前者能夠識別并催化RNA底物的5′-R/Y-3′位點斷裂(Y為嘧啶核苷酸，R是嘌呤核苷酸)，后者能夠識別并催化RNA底物的5′-G/rA-3′位點斷裂(圖1)[19]。研究[19]表明，這2種脫氧核酶催化功能域的堿基序列高度保守，且決定了其具體切割位點，催化功能域的堿基突變會導致脫氧核酶催化活性降低甚至喪失。與之不同，脫氧核酶的結合臂為可變序列，可根據底物RNA的具體序列進行靈活調節。因此，脫氧核酶的催化域決定了其催化活性的高低(或有無)，而結合臂則決定了其底物選擇性。此外，脫氧核酶結合臂的長度還將影響其催化的周轉率。隨著結合臂長度的增加，脫氧核酶與底物的雜交穩定性逐漸增加，有助于兩者靠近結合。但當穩定性過強，脫氧核酶切割底物產生的斷裂片段不易從脫氧核酶上解離下來，將阻礙下一個底物與核酶結合，進而影響脫氧核酶循環。最佳的結合臂長度取決于底物的序列組成和反應條件。

圖1 脫氧核酶8-17和10-23催化域的序列信息[19]

1.2 具有過氧化物酶模擬活性的脫氧核酶

根據G-四鏈體中鏈的走向差異進行劃分，可分為平行G-四鏈體、反平行G-四鏈體和混合型G-四鏈體(圖2)，而G-四鏈體的拓撲結構與G4/hemin-DNAzyme的催化活性密切相關。有研究[23-24]報道，平行結構有利于氯化血紅素通過末端堆疊的方式與其配位，因而平行G-四鏈體結構能夠結合更多血紅素，催化活性明顯高于其他幾種結構。G4/hemin-DNAzyme的催化活性還受G-四鏈體所結合的陽離子種類、環部及末端序列的影響。例如，相比于G-四鏈體3’-端，只有在5’-端增加胸腺嘧啶(T)才能明顯提高G4/hemin-DNAzyme的催化活性[25]。此外，對輔因子血紅素進行優化或化學修飾亦可以改善G4/hemin-DNAzyme的催化活性。如Liu等[26]發現帶組氨末端的氯化血紅素與G-四鏈體的結合能力得到明顯改善，因而所形成的復合體催化活性也得以增強。

圖2 G-四鏈體的結構示意圖[21]

G-三鏈體由G-三分體平面堆疊組成，存在時間短，穩定性較差，被認為是G-四鏈體形成過程中的中間態[27]。與G-四鏈體相比，雖然G-三鏈體在拓撲結構上存在明顯差異，但是具有類似的過氧化物酶模擬活性。此外，由于基于G-三鏈體的分子探針涉及更少的G-C堿基對，因此在設計上更為靈活，近年來引起了科研者的廣泛關注。

基于G4/hemin-DNAzyme、G3/hemin-DNAzyme的催化特性，目前該類酶已被用作信號輸出單元用于構建各種各樣的生化傳感器。例如，利用該類酶模擬辣根過氧化物酶活性，催化H2O2氧化ABTS產生顏色變化，進而構建比色型傳感器(圖3)[28-29]；催化魯米諾產生化學發光，構建熒光型傳感器(圖3)[30]。還可將G4/hemin-DNAzyme修飾在電極上，通過催化H2O2氧化還原性底物產生電信號變化，構建電化學傳感器[31-32]。

圖3 G-四鏈體/血紅素的過氧化物酶模擬脫氧核糖核酸酶[28]

2 脫氧核酶在食品安全檢測中的應用

2.1 重金屬離子的檢測

重金屬具有危害性大、生物富集性強的特征，其會經工業三廢進入食物鏈，在人體內積累可引起慢性中毒甚至死亡。建立痕量重金屬離子檢測技術成為迫切需求，對于防止重金屬攝入、保障食品安全具有重要意義。傳統的重金屬分析方法(如電感耦合等離子體質譜法、原子吸收/發射光譜法)雖然具有準確度、靈敏度高的優點，但涉及復雜的樣品前處理和大型儀器設備，難以滿足食品樣品日常快速檢測需求[33]。目前，已有以鉛[34]、汞[35]、鎘[36]、銅[37]等重金屬為輔因子的特異性脫氧核酶相繼被篩選出。利用脫氧核酶對靶標金屬離子的高親和力，可開發重金屬離子選擇性激活的脫氧核酶探針，在此基礎上，對核酶探針進行化學修飾或結合納米材料，構建熒光、比色、電化學傳感平臺，有望實現對食源性重金屬離子的快速、精準檢測。

例如，Vijitvarasan等[38]基于脫氧核酶開發了一種適用于現場的紙質掃描法檢測Pb2+。首先，將含核酶切割位點(rA位點)底物鏈修飾于AuNP上，Pb2+特異性核酶鏈修飾在磁性微珠(MB)上。兩者混合后，經底物鏈和核酶鏈雜交，可形成MB-脫氧核酶-AuNP復合物。在Pb2+存在下，脫氧核酶被激活，將底物鏈切割成長短不一的兩個片段。附著在AuNP上的DNA短鏈與核酶鏈結合不穩定，容易地從復合體中脫落下來。故施加磁場后，可將AuNP從MB-DNAzyme-AuNP復合物中分離出來。收集上清液中的AuNP并在色譜紙上點樣進行濃縮，然后采用銀增強劑溶液處理。由于硝酸銀能在AuNP表面被還原為灰色的銀顆粒，且銀沉積量與Pb2+的濃度呈正比，因而可根據灰色強度定量分析Pb2+。該方法能選擇性檢測河水中的Pb2+，檢測限為1.1 nmol/L。在該設計中，由于底物鏈修飾于信號輸出基元(AuNP)上，因而底物鏈加入的比例需小于或等于核酶鏈，否則易造成假陽性。然而有限的底物鏈則制約了核酶本身循環切割底物的放大效應，導致檢測靈敏度不佳。

為了避免上述問題，Wang等[39]在設計中引入催化發卡自組裝放大技術，開發了一款基于脫氧核酶的便攜式微流控裝置用于飲用水中Cd2+的超靈敏檢測。其原理如圖4所示，當引用水中存在Cd2+時，Cd2+能特異性激活脫氧核酶切割底物，產生并釋放短的切割片段。后者可打開DNA發卡結構1(H1)，暴露與DNA發卡結構2(H2)雜交位點。由于H2與H1的結合力強于切割片段，故H2能夠競爭性將切割片段擠下來，得到H1和H2的雜交體(H1H2)，實現催化發卡自組裝。釋放出的切割片段又可誘發下一輪催化發卡自組裝，如此循環，即可得到大量H1H2。H1H2的黏性末端能分別與DNA功能化的磁性微珠(MMP)和聚苯乙烯微珠結合，得到MMPs-H1H2-PMPs復合體。將整個反應體系轉移到微流控芯片上，在引入磁場分離MMPs-H1H2-PMPs復合體后，由于進入微孔道的PMPs減少，孔道中的液面柱高明顯低于無Cd2+的水樣。

圖4 使用脫氧核酶功能化微流控芯片可視化檢測飲用水中的鎘離子[39]

與上述檢測體系不同，Lim等[40]采用了具有過氧化物酶模擬活性的G-四鏈體構建比色型3D打印芯片，用于飲用水中無機汞離子(Hg2+)的檢測研究。首先使用3D打印技術制造x含環形DNA模板的一次性芯片，在無Hg2+存在時，含12個T堿基的引物可與環形DNA模板特異性雜交并觸發滾環擴增反應(RCA)產生含多個G-四鏈體結構的長鏈序列。G-四鏈體結構結合氯化血紅素后可催化H2O2氧化ABTS發生顏色變化。而當Hg2+存在時，由于Hg2+可與引物上的T堿基結合形成T-Hg2+-T復合物[41]，無法引發RCA反應生成G-四鏈體，因而最終不能觀察到溶液顏色變化。由于引入了RCA核酸放大技術，該芯片可靈敏檢測自來水樣品中的Hg2+，檢測限低至3.6 μg/L。該策略將檢測平臺轉移到芯片上，實現了設備的微型化，在此基礎上采用裸眼可觀察的比色信號輸出模式，有望在現場、快速檢測方面取得突破。

2.2 食源性致病菌的檢測

食源性致病菌是指通過食物或飲用水進入人體，并引起機體功能障礙的致病性微生物，主要包括大腸桿菌O157:H7、單增李斯特菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、幽門螺桿菌等。當前，食源性致病菌污染已成為食品安全問題的重要來源，對公共衛生體系造成了巨大沖擊。盡早發現并實現致病菌的現場快速檢測，對于避免致病菌引起的疾病暴發及減少其持續流行所帶來的負面影響具有重要意義。然而傳統檢測技術，如菌落形態觀察、生物發光法、聚合酶鏈式反應法等，難以滿足快速檢測需求[42]。以DNA為基礎的脫氧核酶將分子識別元件和催化信號放大元件雙重功能集成于一體，在致病菌的快速、靈敏檢測中顯示出良好的應用前景。

如Yousefi等[43]基于脫氧核酶設計了一種應用于食品包裝袋上的生物傳感器，旨在通過食品包裝袋即可實時評估大腸桿菌污染情況，檢測原理如圖5所示。該傳感器通過將大腸桿菌特異性響應的熒光脫氧核酶探針與透明的環烯烴聚合物薄膜(COP)共價連接而成。當大腸桿菌存在時，熒光脫氧核酶探針被激活，進而切割rA位點產生標記有淬滅基團的短鏈。由于短鏈與脫氧核酶臂結合不穩定，可從脫氧核酶上脫落下來，使得熒光基團和淬滅基團相互遠離，熒光恢復。試驗結果顯示，這種生物傳感器在pH為3～9條件下至少能穩定保存14 d，并且能實現肉、蘋果汁中大腸桿菌的即時檢測，檢測限低至103CFU/mL。該檢測方法簡單、快速，但是由于核酶探針直接與食品接觸，因此有兩個方面的問題值得關注：① 保證核酶探針在復雜食品基質中的穩定性是實現精準檢測的關鍵；② 引入化學熒光基團的安全性，以及消費者的認可度。

圖5 通過在食品包裝上打印大腸桿菌激活的脫氧核酶探針實時監測食品污染的原理圖[43]

而將核酶探針與便攜式檢測平臺結合，不僅可以保證檢測的便捷性和時效性，還可規避探針與復雜基質長期接觸帶來的各種隱患。基于這種理念，Ali等[44]利用脫氧核酶構建了便攜式紙基傳感器檢測幽門螺桿菌。其檢測原理如圖6所示，首先將脫氧核酶修飾于瓊脂糖珠上，后者固定在紙基芯片上。在脫氧核酶的5'-末端設計DNA標簽，以便通過堿基互補與連接有尿素酶的DNA相結合。當幽門螺桿菌存在時，脫氧核酶發生特異性切割反應，得到含有尿素酶的DNA片段，并隨著溶液從紙芯片的傳感域移動到檢測域。之后，尿素酶水解檢測域中的尿素，使溶液pH值升高，最終導致酚紅指示劑的顏色由黃色變為紅色。該傳感器能夠靈敏、特異性地檢測人類糞便樣本中的幽門螺桿菌，并在幾分鐘內提供結果，檢測限低至104CFU/mL。該策略無需借助外界儀器即可完成檢測，為食源性致病菌的快速檢測提供了新思路。

圖6 基于脫氧核酶的比色型紙芯片用于幽門螺桿菌檢測的原理圖[44]

2.3 微生物毒素的檢測

微生物毒素是指由細菌或真菌合成分泌的、不可自復制的有毒化學物質，種類繁多且普遍具有致癌、致畸作用。如赭曲霉毒素A是由青霉菌屬和曲霉菌屬經次級代謝產生的毒素，常見于未妥善保存的谷物、葡萄酒、果汁中，被國際癌癥研究機構列為2B類致癌物質[45]。黃曲霉毒素則是由黃曲霉和寄生曲霉等菌株產生的雙呋喃環類毒素，常見于發霉的花生、玉米、大米等農產品中，1993年被世界衛生組織劃定為1類致癌物[46]。不同于食源致病菌可通過熱處理滅活，大多微生物毒素性質穩定，難以被破壞。因此，發展分析準確、鑒定微生物毒素的傳感技術是避免毒素中毒最有效的途徑。

Zhang等[47]巧妙結合磁分離技術和便攜式血糖儀檢測平臺，開發了功能核酸探針用于赫曲霉素的特異、靈敏分析。其原理如圖7所示，通過在磁珠上固定脫氧核酶底物鏈和特異性識別赫曲霉素的核酸適配體，構建傳感平臺。其中底物鏈末端修飾了轉化酶，核酸適配體的部分序列可與脫氧核酶雜交，從而使脫氧核酶也錨定于磁珠表面。當赫曲霉素存在時，可誘導核酸適配體發生構象變化釋放脫氧核酶。后者則可與底物鏈結合，在Zn2+的輔助下切割底物，使修飾了轉化酶的短鏈從磁珠表面脫落進入溶液。同時，釋放的脫氧核酶又可催化下一個底物斷裂，實現循環釋放大量短鏈。溶液中的轉化酶可催化蔗糖轉化為葡萄糖，后者可通過便攜式血糖儀檢測。試驗表明，該平臺能選擇性檢測食物中的曲霉毒素，檢測限為0.88 pg/mL。

圖7 基于脫氧核酶放大技術的適配體傳感平臺檢測赫曲霉素的工作原理圖[47]

Wang等[48]則開發了基于適體/G-四鏈體脫氧核酶探針的適體傳感器，通過熒光信號變化判斷食品中是否存在黃曲霉毒素B1(AFB1)。當AFB1不存在時，重組的G-四鏈體/氯化血紅素體系可催化無熒光鄰苯二胺(OPD)生成有熒光的2,3-二氨基吩嗪(DAP)。而當AFB1存在時，將誘導核酸適配體發生構象變化，進而破壞G-四鏈體/氯化血紅素體系，因而檢測不到熒光產生。該研究引入磁氧化多壁碳納米管吸附多余的血紅素，有效降低了檢測背景信號，從而實現對AFB1的高靈敏檢測，檢出限低至0.02 ng/mL。相比于比色傳感平臺，熒光傳感平臺在檢測靈敏度方面具有明顯優勢，更加適合微生物毒素這種痕量、高危害性食品污染物的檢測。

2.4 獸藥殘留的檢測

抗生素是最廣泛使用的一類獸藥，常被用于防治畜禽傳染性疾病和抗寄生蟲。殘留在畜禽體內的抗生素最終可通過食物鏈進入人體并富集，從而威脅人類健康[49]。針對抗生素濫用問題，Zhou等[50]構建了一種基于引物交換反應(PER)和脫氧核酶的同步信號放大方法檢測卡拉霉素，檢測原理如圖8所示。當檢測樣品中存在卡那霉素時，其可誘導核酸適配體發生構象變化，進而從發卡1(HP1)上脫落下來，暴露引物結合位點。之后，引物與HP1雜交，在Bst-DNA聚合酶啟動作用下自主合成Mg2+依賴性脫氧核酶序列，該過程可重復進行，產生大量脫氧核酶序列。在Mg2+輔因子的存在下，脫氧核酶循環切割信號發夾底物中的rA位點，釋放出大量游離的G-四鏈體片段。后者與有機染料硫黃素T(ThT)結合后，可顯著增強ThT的熒光，從而實現對卡那霉素的高靈敏度檢測，檢測限低至0.36 nmol/L，且實現對真實牛奶樣品中的卡那霉素的檢測。

圖8 基于引物交換反應和Mg2+依賴性脫氧核酶的同步信號放大檢測卡那霉素的平臺原理圖[50]

同樣采用了G-四鏈體結構，Tang等[51]則利用其過氧化物酶模擬活性實現了對四環素的可視化檢測。當檢測體系中不存在四環素時，G-四鏈體結構可順利結合氯化血紅素，之后催化H2O2徹底氧化TMB，顏色由無色變成黃色。當四環素存在時，其可通過π—π堆積力競爭性結合氯化血紅素，大大降低G4/hemin-DNAzyme復合體的生成，導致TMB不能被充分氧化，溶液顏色呈綠色。該方法通過簡單的顏色變化即可檢測四環霉素，檢測限為3.1 nmol/L。

總體而言，當前基于脫氧核酶的抗生素檢測方法大多需要與核酸適配體結合，通過將核酸適配體對抗生素的特異性識別事件轉化為脫氧核酶的激活事件，從而實現抗生素的選擇性檢測。因此，促進脫氧核酶在抗生素檢測方面廣泛應用的前提在于豐富識別元件或識別機理。

2.5 其他非法成分的檢測

非法食品添加劑、食品接觸材料中有害小分子的遷移等是引發食品安全問題的又一來源。針對上述物質開發精確、快速的檢測技術是食品安全檢測的重要內容之一。如雙酚A(BPA)是一種內分泌干擾化合物，即使在非常低的濃度下也會對人體健康產生不利影響[52]。設計可靠、靈敏的雙酚A檢測方法對于保護食品安全和人類健康具有重要意義。基于此，Pan等[53]將具有信號放大功效的DNA電路與Mg2+依賴性脫氧核酶集成到傳感系統，用于檢測雙酚A。雙酚A與結合適配體結合后，可激活DNA電路，通過鏈置換反應輸出大量輔助鏈。輔助鏈可穩定Mg2+依賴性脫氧核酶構象，使其在Mg2+存在的情況下能將雙標記(FAM和Dabcyl)的底物DNA切割成兩段，導致熒光團和猝滅團的分離，產生熒光信號。該生物傳感器具有良好的選擇性和超高靈敏度，檢測限低至50 fmol/L，能實現牛奶樣品中雙酚A的檢測，且檢測結果與液相色譜結合質譜(LC-MS)無明顯差異。

3 總結與展望

綜上所述，脫氧核酶憑借合成成本低、靶標豐富、特異性高、可設計性強的優點，目前已作為信號識別元件或信號輸出元件被廣泛應用于食品安全檢測領域。結合當前研究開發現狀和未來實際應用需求，基于脫氧核酶的食品檢測傳感器在以下3個方面有待改善：① 在實際檢測體系中的穩定性，盡管脫氧核酶的熱穩定性和耐酸堿性能均優于傳統蛋白酶，但脫氧核酶的構象穩定性很大程度依賴于環境中金屬離子的含量，而大多數情況下實際檢測體系無法滿足這一需求。因此，如何提高脫氧核酶在苛刻環境下的構象穩定性應該是未來研究的重點。② 在復雜體系中的抗干擾能力，由于食品基質復雜，脫氧核酶生物傳感器在實際應用中面臨著其他物質或核酸酶的影響，導致二級結構被破壞。因此，需要綜合評價其在不同復雜樣品基質中對靶標的特異性、靈敏度以及穩定性等性能，并在此基礎上選擇性引入化學修飾以提高其抗酶切穩定性。③ 目前大部分研究工作還停留于實驗室階段，檢測過程繁瑣。與微流控芯片、試紙條、移動設備結合的快速、現場檢測方法的開發將是未來的發展方向。隨著機理的完善及多學科交叉融合，基于脫氧核酶的分子傳感器在檢測性能、平臺構建、應用革新方面都將得到完善，有望在食品安全分析領域發揮重要作用。