芹菜素黃酮氧苷、黃酮碳苷同分異構體抗炎活性評價

李 慧，潘思軼，徐曉云,

（1.江漢大學生命科學學院，湖北武漢 430056；2.華中農(nóng)業(yè)大學食品科學技術學院，湖北武漢 430070）

黃酮類化合物廣泛存在于蔬菜、水果等植物性食品原料中。自然界存在的黃酮類化合物多以黃酮苷的形式存在，即黃酮苷元與糖類結合形成了糖苷鍵，據(jù)此黃酮類化合物可分為黃酮氧苷和黃酮碳苷：黃酮苷元上氧原子與糖鏈以C-O 鏈接形成黃酮-O-糖苷；黃酮苷元上碳原子與糖鏈以C-C 鏈接形成黃酮-C-糖苷[1]。在黃酮類化合物中，黃酮氧苷較黃酮碳苷類化合物常見，例如芹菜素-7-O-β-D-吡喃葡萄糖即大波斯菊苷[2?3]及5-O-β-D-吡喃葡萄糖苷芹菜甙元等。而隨著質(zhì)譜等鑒別技術的發(fā)展，近年來越來越多的黃酮碳苷被發(fā)現(xiàn)，黃酮碳苷的C-糖苷取代常發(fā)生在黃酮苷元母核結構的C6 位或C8 位，如牡荊素和異牡荊素是芹菜素-C-糖苷同分異構體，夏佛塔苷、異夏佛塔苷是葡萄糖和阿拉伯糖兩種不同的糖基配體與芹菜素苷元形成的芹菜素6，8-雙-C-糖苷同分異構體[4]。黃酮類化合物一般具有較低的毒性和廣泛的生物活性。

芹菜素黃酮苷元可以通過抑制NF-κB 信號通路發(fā)揮抗炎活性[5?6]，其形成的芹菜素黃酮苷也顯示出較好的抗炎作用。芹菜素黃酮碳苷天然存在于清熱解毒的植物性材料中，如箬葉[7]、三葉青[8]、綠豆衣[9]、蓮子心[4]，基于脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）刺激建立小鼠巨噬細胞RAW264.7 炎性細胞模型發(fā)現(xiàn)此類植物提取物具有炎性抑制作用[9?10]。除此之外，芹菜素-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷可通過抑制炎性和氧化應激反應減輕LPS 誘導的急性中耳炎[11]。然而關于5-O-β-D-吡喃葡萄糖苷芹菜甙元是否具有抗炎活性尚不明確，芹菜素形成的幾種O-糖苷、C-糖苷同分異構體的活性差異亦尚未見報道。動物模型是常用的體內(nèi)活性評價模型，但動物模型實驗樣品量消耗大，無法針對重要作用靶點進行單一信號通路的研究與確認，因此單一的細胞系模型更有助于評價黃酮類化合物的抗炎活性及作用機制。

THP-1 是人髓系白血病單核細胞，具有與原代單核細胞相似的表型和功能特征，以及穩(wěn)定的遺傳能力[12?13]。LPS 刺激佛波酯（phorbol 12-myristate13-acetate，PMA）分化的THP-1 細胞是常用的人源性炎性細胞模型，以之建立模型，可以有效評價活性成分的抗炎作用，并分析其可能的作用機制[14]。本研究將以THP-1 單核巨噬細胞建立炎性細胞模型，以4 種芹菜素-單-C/O-黃酮苷同分異構體（見表1）：牡荊素、異牡荊素、芹菜素-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、5-Oβ-D-吡喃葡萄糖苷芹菜甙元為研究對象，評價4 種同分異構體的抗炎活性差異，為植物性食品原料膳食攝入芹菜素黃酮苷及營養(yǎng)特性提供指導。

表1 芹菜素及其4 種黃酮苷化學結構Table 1 Structure of apigenin and 4 apigenin glycosides

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

THP-1 單核巨噬細胞實驗室保存 上海細胞庫；5-O-β-D-吡喃葡萄糖苷芹菜甙元、芹菜素-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、牡荊素、異牡荊素 均為HPLC純度≥98%，上海源葉生物科技有限公司；RPMI 培養(yǎng)基 美國hyclone 公司；胎牛血清 澳大利亞Aus-GeneX 公司；GNM15140 青鏈霉素溶液（100X） 杭州吉諾生物醫(yī)藥技術有限公司；噻唑藍（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）、脂多糖（lipopolysaccharide，LPS，L-4391）、豆蔻佛波醇乙酯（phorbol 12-myristate13-acetate，PMA）、β-巰基乙醇 美國Sigma公司；高純總RNA 提取試劑盒 北京艾德萊生物科技有限公司；漿蛋白與核蛋白提取試劑盒、Weatern Blot 分析試劑 美國AspenTech 公司；PrimeScriptTM reagent Kit with gDNA Eraser 反轉(zhuǎn)錄試劑盒、PCR SYBR Premix Ex TaqTM Ⅱ熒光定量試劑盒TaKaRa 公司；細胞因子酶聯(lián)免疫試劑盒 欣博盛生物科技有限公司；所有分析用試劑均為國產(chǎn)分析純。

Multifuge X1R 高速冷凍離心機、全波長讀數(shù)儀Thermo Fisher Scientific 公司；ECLIPSE TS100 倒置顯微鏡 日本尼康公司；DYY-8C 凝膠電泳儀北京六一儀器廠；細胞培養(yǎng)板 美國Corning 公司；細胞培養(yǎng)瓶 德國Greiner 公司；MG96G PCR 儀杭州朗基科學儀器有限公司；ChemiDoc MP 凝膠成像系統(tǒng) 美國BIO LEGEND 公司；qTOWER2.2 熒光定量PCR 儀 德國Analytik jena 公司；AX-Ⅱ暗匣 廣東粵華醫(yī)療器械廠有限公司；LiDE110 DYY-6C掃描儀 日本Canon 公司；0.45μm PVDF 膜 美國Millipore 公司；柯達醫(yī)用X 射線膠片 美國Kodak公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) THP-1 單核巨噬細胞以RPMI完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，RPMI 完全培養(yǎng)基由10% FBS、100 U/mL 青霉素、100 μg/mL 鏈霉素、0.1 μmol/L的β巰基乙醇組成，細胞于含5% CO2，90%濕度，37 ℃條件下的CO2恒溫培養(yǎng)箱進行懸浮培養(yǎng)，每24 h 于倒置顯微鏡下觀察，當密度達到70%～80%左右時進行分瓶傳代[14]。

1.2.2 MTT 試驗 采用MTT 法[15]測定黃酮類化合物對THP-1 單核巨噬細胞的毒性作用。

設置3 個組別：實驗組，稀釋細胞懸液，加入PMA 試劑（終濃度為0.1 μmol/L），接種100 μL 細胞到96 孔板中，使其密度為3×104個/孔，細胞培養(yǎng)板放入CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。12 h 后細胞貼壁完全，去上清液，以溫熱的PBS 輕輕清洗細胞，去PBS，加入新鮮RPMI 完全培養(yǎng)基，靜息24 h。以不含血清的RPMI 培養(yǎng)液分別配制濃度為5 μmol/L 的api-5-Oglu、api-7-O-glu、vitexin、isovitexin 溶液，去細胞上清液，以溫熱的PBS 輕輕洗滌細胞，去PBS，分別加入配制好的黃酮類化合物溶液?？瞻捉M，不接種細胞，加入100 μL RPMI 完全培養(yǎng)基培養(yǎng)到細胞孔板中，且以不含血清的RPMI 培養(yǎng)液代替黃酮類化合物溶液處理細胞孔板。正常組（CK 組），THP-1 細胞接種量同樣品組，且以不含血清的RPMI 培養(yǎng)液代替黃酮類化合物溶液處理細胞孔板。樣品組與2 個空白組均設8 個平行。

給藥完成后，細胞孔板放入CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24 h 后取出去細胞上清液，加入配制好的MTT 溶液（濃度為0.5 mg/mL），放回CO2培養(yǎng)箱中避光孵育3～4 h。去MTT 溶液，以150 μL 二甲亞砜溶解細胞中甲瓚結晶，于37℃震蕩孵育10 min，在酶標儀上讀取490 nm 處吸光值。

計算細胞存活率，公式如下：

式中：AT：樣品組在490 nm 處的吸光值；AN：空白組在490 nm 處的吸光值；AC：正常組（CK 組）在490 nm 處的吸光值。

1.2.3 Western Blot 法檢測細胞中環(huán)氧合酶-2（cyclooxygenase-2，COX-2）含量 設置3 個組別：實驗組：稀釋細胞懸液，接種2 mL 細胞到6 孔板中，使其密度為1.5×107個/孔，待細胞覆蓋孔板底部80%～90%時，加入PMA 試劑（終濃度為0.1 μmol/L），放入CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。12 h 后細胞貼壁完全，去上清液，以溫熱的PBS 輕輕清洗細胞，去PBS，加入新鮮RPMI 完全培養(yǎng)基，靜息24 h。以不含血清的RPMI培養(yǎng)液分別配制濃度為5 μmol/L 的api-5-O-glu、api-7-O-glu、vitexin、isovitexin 溶液，去細胞上清液，以溫熱的PBS 輕輕洗滌細胞，去PBS，分別加入配制好的黃酮類化合物溶液。模型組（LPS 組），THP-1細胞接種量同樣品組，且以不含血清的RPMI 培養(yǎng)液代替黃酮類化合物溶液處理細胞孔板。正常組（CK 組），THP-1 細胞接種量同樣品組，且以不含血清的RPMI 培養(yǎng)液代替黃酮類化合物處理細胞孔板。各組別均設3 個平行。

給藥完成后，細胞孔板放入CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。3 h 后取出，正常組（CK 組）不加脂多糖，實驗組和模型組（LPS 組）加入脂多糖，使LPS 終濃度為1 μg/mL，將6 孔板放回培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)30 min。以RPMI 裂解液裂解細胞收集細胞總蛋白樣品，并采用WB 法測定總蛋白中COX-2 含量[16]，以內(nèi)參計算各組別COX-2 的相對表達量。

1.2.4 酶聯(lián)免疫吸附檢測細胞上清液細胞因子的含量 設置3 個組別，各組別設置同1.2.3，但細胞接種密度為5×106個/孔，每孔接種2 mL 細胞懸液到12孔板中，待實驗組和模型組加入脂多糖后，將孔板放回細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h。收集細胞上清液，依據(jù)酶聯(lián)免疫法試劑盒說明書測定細胞上清液中細胞因子含量。

1.2.5 實時熒光定量PCR 法檢測細胞中細胞因子mRNA 的含量 實驗組別設置和細胞處理同1.2.4。以Trizol 試劑裂解去上清液的細胞，收集細胞裂解液。采用實時熒光定量PCR 法測定細胞中細胞因子mRNA 的相對含量，即以2?ΔΔC（T）法計算各組別相對模型組（LPS 組）的細胞因子mRNA 擴增倍數(shù)[17]。

樣品中RNA 提取、反轉(zhuǎn)錄、定量方法分別按試劑盒說明書操作。

各指標引物信息見表2：

表2 熒光定量PCR 法檢測細胞因子及內(nèi)參引物信息Table 2 Primer information of cytokines and internal primers in fluorescence quantitative PCR

1.2.6 Western Blot 法檢測細胞質(zhì)、細胞核P65 含量設置3 個組別，各組別設置同1.2.3，但細胞接種密度為5×106個/孔，每孔接種5 mL 細胞懸液到直徑6 cm的細胞培養(yǎng)皿中。待細胞孔板中實驗組和模型組加入脂多糖并放回培養(yǎng)箱中培養(yǎng)30 min 后，按試劑盒說明分別收集提取細胞質(zhì)與細胞核蛋白樣品，采用WB 法測定樣品中P65 含量[18]，以內(nèi)參計算各組別P65 的相對表達量，計算方式同COX-2。

1.2.7 Western Blot 法檢測細胞中IκBα、IKKβ的變化 設置3 個組別，各組別設置同1.2.3，但細胞接種密度為1×107個/孔，每孔接種2 mL 細胞懸液到6 孔板中。待細胞孔板中實驗組和模型組加入脂多糖并放回培養(yǎng)箱培養(yǎng)30 min 后，以RPMI 裂解液裂解細胞，收集細胞裂解液，采用WB 法測定總蛋白中IκBα、IKKβ、P-IκBα、P-IKKβ含量[18]，以內(nèi)參計算各組別IκBα、IKKβ、P-IκBα、P-IKKβ的相對表達量，計算方式同COX-2。

1.3 數(shù)據(jù)處理

實驗結果表示為平均值±標準差，采用軟件SAS 8.0 進行LSD 多重比較分析數(shù)據(jù)顯著性，P＜0.05 表明差異顯著，P＜0.01 表明差異極顯著。

2 結果與分析

2.1 黃酮類化合物對TPH-1 單核巨噬細胞的毒性作用

前期研究表明，在基于脂多糖刺激RAW264.7小鼠巨噬細胞建立的炎性細胞模型中，濃度為5 μmol/L 的4 種芹菜素黃酮苷同分異構體對COX-2 酶mRNA 的表達就具有顯著的差異性抑制作用（P＜0.05），其中，芹菜素-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、牡荊素對COX-2酶mRNA 的表達顯示出更好的抑制活性[19]。本研究將進一步探究4 種同分異構體在5 μmol/L 濃度下的抗炎活性差異及機理。如表3 所示，與CK 組相比，5 μmol/L 的芹菜素-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、5-O-β-D-吡喃葡萄糖苷芹菜甙元、牡荊素、異牡荊素處理下，細胞存活率無顯著性差異（P＞0.05），表明上述化合物對THP-1 單核巨噬細胞均無細胞毒性作用。

表3 黃酮類化合物對THP-1 單核巨噬細胞的毒性作用Table 3 Toxicity of flavonoids on THP-1 macrophage cells

2.2 黃酮類化合物對THP-1 單核巨噬細胞炎性模型中COX-2 調(diào)控作用

如圖1 所示，LPS 作用后，THP-1 單核巨噬細胞炎性模型中COX-2 的表達極顯著上升（P＜0.01），COX-2 是NF-κB 核轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控的下游表達產(chǎn)物，在特定組織器官發(fā)生炎性反應時被誘導產(chǎn)生，具有快速應答炎性反應的特質(zhì)，是炎性反應中常用的評價指標[20]。

圖1 4 種芹菜素黃酮苷對脂多糖刺激下THP-1 單核巨噬細胞中COX-2 的影響Fig.1 Influence of 4 apigenin glycosides on COX-2 in THP-1 macrophage cell lines stimulated by LPS

芹菜素等多種黃酮類化合物可以作用于巨噬細胞并對COX-2 顯示較好的抑制效果[21?23]。在本研究中，牡荊素和異牡荊素均能夠極顯著地抑制COX-2 酶在蛋白水平上的表達（P＜0.01），且牡荊素的抑制作用顯著優(yōu)于異牡荊素（P＜0.05）。而在筆者前期的研究中[19]，RAW264.7 小鼠巨噬細胞中，牡荊素顯示出較異牡荊素更好的COX-2 酶mRNA 活性0.05），表明在抑制COX-2 基因的轉(zhuǎn)錄和蛋白的表達方面，C6 位碳苷取代的牡荊素碳強于C8 位碳苷取代的異牡荊素。

2.3 黃酮類化合物對THP-1 單核巨噬細胞炎性模型細胞因子的影響

表4 表明1 μg/mL 的LPS 刺激PMA 分化后的THP-1 后，細胞內(nèi)TNF-α在蛋白水平和基因水平的表達極顯著增強（P＜0.01）。脂多糖是誘導細胞產(chǎn)生炎性反應的較強刺激物[24]，細胞內(nèi)腫瘤壞死因子TNF-α含量顯著提高是判斷炎性發(fā)生的重要標志之一[25]。此外，脂多糖還可以促進細胞中細胞因子的表達。本實驗中，LPS 刺激使IL-1β（Interleukin 1β，白細胞介素1β）的含量極顯著增加（P＜0.01），同時LPS還極顯著增強了IL-6（Interleukin 6，白細胞介素6）的含量（P＜0.01），極顯著增加了IL-8（Interleukin 8，白細胞介素8）和IL-10（Interleukin 10，白細胞介素10）mRNA 的表達（P＜0.01）。

表4 4 種芹菜素黃酮苷對脂多糖刺激下THP-1 單核巨噬細胞中細胞因子的影響Table 4 Influence of 4 apigenin glycosides on cytokines in THP-1 macrophage cell lines stimulated by LPS

與LPS 組相比，2 種芹菜素黃酮碳苷對細胞炎性因子的抑制作用強于2 種芹菜素黃酮氧苷。4 種黃酮苷均可顯著降低IL-10 mRNA 的含量（P＜0.01），但5-O-β-D-吡喃葡萄糖苷芹菜甙元對除IL-10 mRNA外其余各指標無顯著抑制作用（P＞0.05）；而芹菜素-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷對TNF-α的產(chǎn)生有顯著抑制作用（P＜0.05）；此外，牡荊素可以極顯著抑制IL-6 的表達（P＜0.01）和TNF-αmRNA 的相對含量（P＜0.05）；異牡荊素可以極顯著抑制IL-1β和IL-6 蛋白的表達（P＜0.01）、IL-8 基因的轉(zhuǎn)錄（P＜0.01）。綜上，基于對多種細胞因子的抑制作用，異牡荊素相較于其他3 種芹菜素黃酮苷顯示出最好的抗炎活性。

值得注意的是，當作用濃度為5μmol/L 時，5-Oβ-D-吡喃葡萄糖苷芹菜甙元促進了巨噬細胞中IL-1β表達升高。脂多糖是革蘭氏陰性細菌外膜的主要組成部分，可以引起強烈的炎性反應，實驗以1 μg/mL 脂多糖刺激TPH-1 單核巨噬細胞建立了炎性細胞模型。IL-1β是一種主要由單核巨噬細胞分泌的多效性細胞因子，作為炎癥反應經(jīng)典的促炎因子，在低濃度時IL-1β可以通過級聯(lián)反應放大炎癥反應，而局部高濃度的IL-1β則主要發(fā)揮內(nèi)分泌調(diào)節(jié)作用，可以增強宿主巨噬細胞殺傷病原微生物的能力和游走能力[25]。實驗濃度下的5-O-β-D-吡喃葡萄糖苷芹菜甙元對IL-1β分泌的促進作用可能由此增強宿主細胞抵御病原微生物的能力。

2.4 黃酮類化合物對THP-1 單核巨噬細胞炎性模型中P65 調(diào)控作用

NF-κB 蛋白家族迅速進入細胞核并啟動各種κB 依賴性基因的表達，如細胞因子TNF-α、IL-6 和IL-1β，同時細胞因子可以反饋調(diào)控NF-κB[26]。P65是NF-κB 蛋白家族的重要成員，具有重要的結構轉(zhuǎn)錄激活域（transcription activation domain，TAD），TAD 結構的存在對于細胞因子基因表達是必不可少的[27]。

通過計算P65 蛋白對內(nèi)參的相對含量，分析4 種芹菜素黃酮苷對脂多糖刺激下THP-1 單核巨噬細胞核和細胞質(zhì)中P65 的影響。脂多糖作用30 min后，細胞核P65 較大程度地增加（見圖2b）。芹菜素-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷與8 位碳苷取代形成的異牡荊素均極顯著地抑制了P65 的核移位作用（P＜0.01），即細胞核內(nèi)P65 含量顯著下降，異牡荊素的8 位碳苷取代強于7 位氧苷取代的抑制作用（P＜0.01），可能由此異牡荊素對P65 核轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控的下游炎性指標如IL-1β、IL-6、IL-8、IL-10 發(fā)揮了較強的抑制作用。

圖2 黃酮類化合物對脂多糖刺激下THP-1 單核巨噬細胞核P65 的影響Fig.2 Effects of flavonoids on THP-1 mononuclear macrophage nucleus P65 stimulated by LSP

2.5 黃酮類化合物對THP-1 單核巨噬細胞炎性模型P-IκBα、P-IKKβ 信號通路的調(diào)控作用

通過計算相對表達量分析黃酮類化合物對脂多糖刺激下THP-1 單核巨噬細胞中IκBα和IKKβ變化。脂多糖作用30 min 后促進細胞內(nèi)IκBα和IKKβ發(fā)生磷酸化反應（分別以P-IκBα、P-IKKβ進行定量）（見圖3b、圖3c）。5 μmol/L 芹菜素-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷預處理后，對IκBα的磷酸化無顯著影響（P＞0.05），5 μmol/L 5-O-β-D-吡喃葡萄糖苷芹菜甙元、牡荊素、異牡荊素則在一定程度上促進了IκBα的磷酸化，4 種黃酮類化合物均極顯著促進了IκBα總表達量的增加（P＜0.01）。5 μmol/L 5-O-β-D-吡喃葡萄糖苷芹菜甙元預處理后，極顯著抑制了IKKβ的表達（P＜0.01），但4 種黃酮類化合物均在一定程度上極顯著地促進了IKKβ的磷酸化（P＜0.01）。這表明4 種黃酮類化合物的預處理未對LPS 刺激THP-1 單核巨噬細胞下IκBα和IKKβ的磷酸化反應發(fā)揮抑制作用。因此，4 種芹菜素黃酮苷并非通過直接抑制IκBα和IKKβ的磷酸化作用而抑制COX-2 或炎性因子。

3 討 論

黃酮類化合物為機體組織利用并發(fā)揮不同生理活性的過程中，第一步反應即為吸收。大量研究表明黃酮類化合物在腸道的主要吸收方式為被動擴散[28?30]，而分子結構的多樣性與其吸收存在本質(zhì)聯(lián)系，多項研究表明糖苷取代位置及數(shù)目的不同會影響黃酮類化合物的腸吸收。本團隊前期關于黃酮類化合物的轉(zhuǎn)運攝入實驗結果表明芹菜素苷元的吸收率顯著高于牡荊素和異牡荊素[31?32]。而Chen 等[33]在對異戊二烯基取代的黃酮類化合物的研究表明，當有兩個或兩個以上的糖基取代環(huán)上羥基時，黃酮類化合物腸吸收顯著降低；減少一個糖基后能在一定程度上增加黃酮類化合物的吸收，但無糖基取代的黃酮苷元吸收卻并未如預期中得以提高，原因在于苷元水溶性差（＜0.5 μg/mL）。而黃酮碳苷是一類極性相對較大的黃酮類化合物，在水溶液中具有較好的溶解性，這可能是其本研究中芹菜素黃酮碳苷較其氧苷同分異構體發(fā)揮更好抗炎活性的原因之一。

黃酮苷一般會經(jīng)過水解代謝為黃酮苷元后，進一步在機體中被吸收利用[34]，吸收利用度和其在體內(nèi)的作用時間也是導致不同結構黃酮苷發(fā)揮不同生物活性的原因之一。研究表明：牡荊素、異牡荊素等黃酮碳苷在大鼠體內(nèi)吸收較好，吸收迅速，給藥5 min均可檢出，1～2 h 血藥濃度達到峰濃度，但兩者的吸收率相差不大，分別為5.82%與5.53%[35]。但牡荊素攝入后可快速消除，廣泛分布于各組織，肝、腎組織濃度最高，主要通過肝臟和腎臟代謝排泄[36]。異牡荊素與牡荊素的消除速度不同，灌胃給藥牡異荊素消除較牡荊素慢，靜脈給藥異牡荊素的消除速度也顯著慢于牡荊素，表明C-8 位的碳苷取代導致了異牡荊素可在機體存留更長時間[37]。因此，盡管牡荊素與異牡荊素具有相近的吸收率，然而異牡荊素在機體內(nèi)具有更慢的消除速度即更長的作用時間，這可能使其抗炎活性強于牡荊素。

黃酮類化合物對巨噬細胞炎性反應的抑制活性主要在于抑制NF-κB 信號通路[38]。IKKβ對NFκB 信號通路經(jīng)典途徑的激活發(fā)揮著不可取代的作用，在典型的NF-κB 信號通路經(jīng)典途徑中，IKKβ與IκBα的Ser32 和Ser36 磷酸化存在充分必要條件關系，然而IκBα磷酸化對于NF-κB 信號通路經(jīng)典途徑并不是必須的[29]。本研究中異牡荊素通過極顯著地降低了NF-κB 蛋白家族中P65 核轉(zhuǎn)錄因子發(fā)生核移位作用（P＜0.01），進而極顯著地抑制了下游炎性指標COX-2、IL-1β、IL-6 的表達（P＜0.01），發(fā)揮了較強的抗炎作用。但異牡荊素對P65 的抑制作用并非是通過對上游調(diào)控蛋白IKKβ和IκBα的抑制而實現(xiàn)的，這表明其對巨噬細胞中炎性反應的抑制活性并非依賴于IκBα磷酸化的NF-κB 信號通路。后續(xù)可對IkBα上游通路中AKT、PDK1、PI3K 等蛋白的表達進行檢測分析，探究異牡荊素的抗炎機制。

4 結 論

研究基于THP-1 單核巨噬細胞評價了2 種芹菜素黃酮氧苷和2 種芹菜素黃酮碳苷的抗炎活性，結果顯示芹菜素黃酮碳苷相對其黃酮氧苷具有更好的抗炎活性，尤其異牡荊素極顯著抑制了COX-2、IL-1β和IL-6（P＜0.01）的表達，極顯著抑制核轉(zhuǎn)錄因子P65 的入核（P＜0.01），發(fā)揮了最強的抗炎作用，但異牡荊素未通過抑制IκBα、IKKβ而抑制NF-κB 蛋白家族P65 的核移位作用，即在人源的THP-1 單核巨噬細胞炎性模型中，異牡荊素對抗炎活性并非是通過IκBα依賴的NF-κB 信號通路實現(xiàn)。