人β-防御素3轉染脂肪干細胞成骨分化潛能及抗牙周炎致病菌的作用

蔣莉莉, 張艷東, 胡碩紅

(1. 河北省張家口宣鋼醫院 口腔科, 河北 張家口, 075100;2. 河北北方學院附屬第二醫院 重癥科, 河北 張家口, 075100;3. 海南省海口市總醫院 口腔科, 海南 海口, 570100)

難治性牙周病是發生在牙周支持組織的慢性感染性疾病，是造成成人牙齒缺失的重要原因[1]。目前臨床主要治療方法為全身局部應用抗生素及牙周引導組織再生手術等，但成功率較低[2-3]。β-防御素是一類重要的內源性抗菌肽，可調節機體免疫應答和炎癥反應[4]。人β-防御素3(hβD-3)被認為是最具有潛力的防御素類抗菌肽，可有效抵抗牙周支持組織的病菌[5]。但hβD-3在機體內含量很少，且很難在體外大量合成。研究[6]發現，應用基因工程技術可以大量生成hβD-3。人脂肪干細胞(hADSCs)是具有多向分化潛能的干細胞，易獲取、易培養，增殖速度快，已被安全有效地應用在退行性骨關節炎、糖尿病及其并發癥和創傷修復等的治療中，其可在基因工程中用于治療牙周骨缺損[7]。有報道應用重組腺相關病毒和慢病毒為載體成功介導人滑膜間質干細胞及軟骨細胞，并通過動物模型驗證。因此，本研究采用慢病毒介導hβD-3基因轉染hADSCs, 探討hβD-3轉染hADSCs成骨分化潛能及體外抗牙周炎致病菌的作用，以期尋找治療難治性牙周炎牙周骨缺損的新方法。

1 材料與方法

1.1 主要材料與儀器

DMEM培養基(美國Gibco公司), hADSCs成骨誘導分化培養基[賽業(蘇州)生物科技有限公司], 0.02% 乙二胺四乙酸(EDTA)+0.25%胰酶(美國Gibco公司)，I型膠原酶(上海慧穎生物科技有限公司), MH瓊脂培養基(廣東環凱微生物科技有限公司), BHI瓊脂培養基(上海邦景實業有限公司)，RNA提取試劑盒和RNA反轉錄試劑盒(美國Promega Corporation公司), SYBR Green RT-PCR 試劑盒(日本TaKaRa公司), MA-6000實時熒光定量PCR儀(蘇州雅睿生物技術有限公司), MB-530酶標儀(深圳市匯松科技發展有限公司), CytoFLEX LX流式細胞儀(美國Beckman-Coulter公司), CKX41倒置顯微鏡(日本Olympus公司)。

1.2 脂肪干細胞的培養與鑒定

本研究經倫理委員會審批且志愿者知情同意。在對志愿者行吸脂術時，用無菌管提取腹部脂肪組織20 mL左右，加入同等體積的磷酸鹽緩沖液(PBS)反復沖洗，剪碎組織后1 h內移入離心管，加入0.075%的Ⅰ型膠原酶，震蕩消化后加入DMEM培養基終止消化，以800轉/min離心10 min, 采用差異貼壁法從成熟脂肪細胞、血細胞中分離hADSCs, 細胞在37 ℃、5% CO2的培養箱中培養，每日觀察細胞生長狀態，每隔3 d進行換液，待細胞長到培養瓶底部的90%左右后進行傳代，取第3代細胞觀察細胞形態，并用流式細胞儀對細胞免疫表型(CD29/CD44)進行鑒定。

1.3 hβD-3基因的慢病毒載體轉染hADSCs

取第3代hADSCs進行轉染，引物設計: 利用SGD軟件設計引物, 5′端序列為5′-CTAGCTAGCCAAATCCATAGGG-AGCTCTG-3′; GCTAGC為限制性內切酶Nhel的酶切位點, ATA為終止密碼子。3′端序列為5′-GGGTTTACC-GGTCATGTTTCAGGGTTTTTATT-3′; ACCGGT為限制性內切酶Agel的酶切位點, AGG為終止密碼子。重組質粒構建: 抽提hADSCs的總RNA, 逆轉錄反應合成cDNA。采用聚合酶鏈反應(PCR)法擴增hβD-3至1.3 kb, 將Agel和Nhel從10 U/μL稀釋到1 U/μL, 將擴增產物雙酶切，并于70 ℃下滅活10 min, 100 V電泳后從質量濃度10 g/L瓊脂糖凝膠上的1.3 kb條帶處割膠，同時將已包含EGFP報告基因的pFUGW用Agel和Nhel雙酶切，將雙酶切后的載體和割下的膠帶按1∶3比例在16 ℃下反應1 h, 期間加入T4 DNA, 即得到pFUGW-hβD-3重組質粒。病毒包裝: 擴增pFUGW-hβD-3后，將質粒pMD2. G和psPAX2提純濃縮至1 μg/μL, 在雙蒸水中加入psPAX2 9 μg、pFUGW-hβD-3 31 μg、pMD2.G 10 μg, 總容量調至1 600 μL。加入BES 1 750 μL和2.5 mol/L的氯化鈣(CaC12)150 μL, 混勻后室溫下放置20 min。逐滴將上述混合物加入含293T細胞的培養瓶，將培養瓶保存于37 ℃、5% CO2培養箱中16 h, 棄上清，用0.45 μm濾紙過濾，將所得的病毒液(plentiV6-hβD-3)凍存于-80 ℃下備用。

1.4 增殖能力檢測

將細胞分為3組: 對照組、空載組與實驗組，對照組不作處理，空載組轉染不含hβD-3基因的慢病毒載體，實驗組利用質粒構建含hβD-3基因的慢病毒載體并轉染hADSCs, 細胞長滿培養瓶底部的90%左右時，消化離心后，以細胞培養液重懸，按50個/cm2密度接種于24孔板中，培養8 d, 每天分別取3孔，消化細胞后，采用細胞計數板對細胞進行計數，取平均值，繪制hADSCs生長曲線，橫坐標為培養時間，縱坐標為細胞數。比較3組hADSCs的增殖能力。

1.5 分化能力檢測

對照組不作處理，空載組與實驗組均加入成骨分化誘導液，誘導7、14 d后應用實時熒光定量PCR檢測3組細胞中成骨相關標志物[堿性磷酸酶(ALP)、Ⅰ-型膠原蛋白(Col-Ⅰ)、骨橋蛋白(OPN)、骨鈣素(OCN)]的mRNA表達量，以評價hADSCs的分化能力。

方法如下: 用預冷的PBS漂洗細胞，每孔加500 μL裂解液, 5 min后收集混懸液，保存于-20 ℃待檢，通過RNA提取試劑盒提取總RNA, 使用PrimeScipt RT試劑盒和莖環引物(5′-GTCGTATCAGCGAGGTATTCGTG-3′)對分離的RNA進行逆轉錄; 通過實時PCR檢測系統使用SYBR試劑盒進行實時PCR, 將反應物在96孔板中于95 ℃擴增5 min, 然后95 ℃10 s, 55.7 ℃ 30 s, 進行40個循環; 以GAPDH為內參, 2-△△CT為目的基因相對表達強度,ALP的正向引物序列為5′-TAGCGTAGTCCACCACTAAGGCC-3′, 反向引物序列為5′-GAGCTCTGATTACTACGTCAGTCG-3′,Col-Ⅰ的正向引物序列為5′-GCCTGAAGCTGCCAGTTGAAGTC-3′, 反向引物序列為5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′,OPN的正向引物序列為5′-CTAAGCATGCTACAATATTCGGTA-3′, 反向引物序列為5′-AGGCCTTGATGCCGTTAGCT-3′,OCN的正向引物序列為5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′, 反向引物序列為5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′,GAPDH的正向引物序列為5′-GTGCTAGAGCTCGTGATTCGCGTC-3′, 反向引物序列為5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。

1.6 體外抑菌能力檢測

采用瓊脂彌散抑菌圈的方法進行樣品測定。將對數生長期的葡萄球菌、卟啉單胞菌分別均勻涂布于MH瓊脂培養基平板、BHI瓊脂平板上，并將卟啉單胞菌BHI瓊脂平板倒置在恒溫(37 ℃)厭氧箱中進行為期72 h的厭氧培養。待菌液充分吸收后，利用直徑為3 mm的打孔器均勻打孔。將純化后的實驗組hβD-3-hADSCs按不同密度(10個/cm2、100個/cm2、1 000個/cm2)接種于培養基孔中，分別記為低密度組、中密度組、高密度組，對照組與空載組的hADSCs以密度1 000個/cm2接種于培養基孔中, 37 ℃孵育過夜。利用電子數顯卡尺測量抑菌圈的直徑，重復5次，取平均值，另設置抗生素陽性對照組，抗生素陽性對照組分別為米諾環素組(30 μg)、環丙沙星組(5 μg)。

1.7 統計學方法

2 結 果

2.1 hADSCs的鏡下觀察及表面抗原表達

顯微鏡下觀察原代及第3代hADSCs, 原代細胞培養2 d即可觀察到細胞貼壁，大多為梭形，有少量的星形或分叉形細胞(圖1A); 細胞培養傳至P3代時，可觀察到細胞呈漩渦狀排列，幾乎全呈長梭形(圖1B)。流式細胞儀結果顯示, hADSCs的表面標記物CD29、CD44均呈強陽性，陽性率為92.4%、90.0%, 符合干細胞的表面抗原表達，表明hADSCs純度較高，見圖1C、圖1D。

A: 原代hADSCs(放大100倍); B: 第3代hADSCs(放大100倍); C: CD29表達; D: CD44表達。圖1 hADSCs的鏡下觀察及表面抗原表達

2.2 增殖能力檢測

3組hADSCs生長曲線均呈現出“S”形，培養不同時間時, 3組細胞數量比較，差異無統計學意義(P>0.05)。見圖2。

圖2 細胞生長曲線

2.3 誘導7 d后形態學觀察

誘導7 d后，對照組細胞仍呈長梭形，空載組與實驗組細胞核變大，形態開始變寬大扁平，有向多角形變化的趨勢。見圖3。

A: 對照組; B: 實驗組; C: 空載組。圖3 細胞誘導7 d后形態學觀察

2.4 ALP、Col-Ⅰ、OPN、OCN mRNA相對表達量

誘導7、14 d時，空載組與實驗組的ALP、Col-Ⅰ、OPN、OCNmRNA相對表達量均高于對照組，差異有統計學意義(P<0.05); 空載組與實驗組誘導14 d時的ALP、Col-Ⅰ、OPN、OCNmRNA相對表達量高于誘導7 d時，差異有統計學意義(P<0.05)。見圖4。

A: ALP mRNA相對表達量; B: Col-Ⅰ mRNA相對表達量; C: OPN mRNA相對表達量; D: OCN mRNA相對表達量。與對照組比較, *P<0.05; 與誘導7 d時比較, #P<0.05。圖4 ALP、Col-Ⅰ、OPN、OCN mRNA相對表達量

2.5 體外抑菌能力檢測

葡萄球菌抑菌實驗中，低密度組抑菌圈小于米諾環素組與環丙沙星組，差異有統計學意義(t=20.120,P<0.001;t=6.149,P<0.001); 中密度組抑菌圈大于環丙沙星組，差異有統計學意義(t=7.250,P<0.001), 與米諾環素組抑菌圈比較，差異無統計學意義(t=0.857,P=0.416); 高密度組抑菌圈大于米諾環素組與環丙沙星組，差異有統計學意義(t=8.061,P<0.001;t=15.233,P<0.001)。卟啉單胞菌抑菌實驗中，低密度組抑菌圈小于米諾環素組與環丙沙星組，差異有統計學意義(t=6.768,P<0.001;t=15.765,P<0.001); 中密度組抑菌圈大于米諾環素組，差異有統計學意義(t=8.216,P<0.001), 與環丙沙星組比較，差異無統計學意義(t=1.158,P=0.250); 高密度組抑菌圈大于米諾環素組與環丙沙星組，差異有統計學意義(t=13.457,P<0.001;t=10.256,P<0.001)。見表1。

表1 各組抑菌圈直徑比較 mm

3 討 論

牙周炎由牙菌斑中細菌侵犯牙周引起，好發于35歲以上的成年人群，男性發病率高于女性[8]。難治性牙周病指由某些特異性微生物引起的感染，治療成功率較低，可導致患者牙齒缺損，嚴重影響患者正常工作和生活[9]。因此，尋找安全有效的治療方法具有重要的意義。β-防御素是一類富含二硫鍵的陽離子型多肽，是動物黏膜組織抵御外界病原微生物侵襲的第一道化學屏障，是生物免疫系統中的重要調節分子[10]。在β-防御素家族中, hβD-3對金黃色葡萄球菌等革蘭陽性菌、革蘭陰性菌以及酵母、白色念珠菌都具有強烈的殺傷作用，且在生理鹽水中活性不受影響，其對福賽氏類桿菌、齒密螺旋體、牙齦卟啉單胞菌、牙齦卟啉菌等的殺傷能力遠大于其他種類防御素[11]，故可采用hβD-3治療難治性牙周病。但hβD-3很難在體內大量生成，因此，尋找體外大量生成hβD-3的方法極為關鍵。

近年來，干細胞治療牙周骨缺損的可能性被提出, hADSCs取材簡便、來源豐富、易于培養，對機體損傷小，且具有多向分化潛能[12-13]。因此本研究選用脂肪干細胞作為種子細胞。本研究結果發現，顯微鏡下原代細胞培養2 d即可觀察到細胞貼壁，大多為梭形，有少量的星形或分叉形細胞; 細胞培養傳至P3代時，可觀察到細胞呈漩渦狀排列，幾乎全呈長梭形，符合干細胞形態學。流式細胞儀結果顯示, hADSCs的表面標記物CD29、CD44均呈強陽性，陽性率為92.4%、90.0%, 符合干細胞的表面抗原表達，表明hADSCs純度較高。3組細胞生長曲線均呈現出“S”形，符合細胞的生長規律，且在7～8 d保持穩定，提示轉染后的hADSCs并未無限制生長。

本研究結果還顯示，誘導7 d后，對照組細胞仍呈長梭形，空載組與實驗組細胞核變大，形態開始變寬大扁平，有向多角形變化的趨勢。誘導7、14 d時，空載組與實驗組的ALP、Col-Ⅰ、OPN、OCNmRNA相對表達量均高于對照組，空載組與實驗組誘導14 d時的ALP、Col-Ⅰ、OPN、OCNmRNA相對表達量高于誘導7 d時，提示轉染后的hADSCs具有成骨分化的潛能。轉染后的hADSCs可直接向成骨方向分化，以促進骨折愈合及加速骨缺損修復，有助于治療牙周缺損。在葡萄球菌、卟啉單胞菌抑菌實驗中，高密度組抑菌圈均大于米諾環素組與環丙沙星組，提示轉染后的hADSCs可穩定表達hβD-3, 且具有一定的抗菌性。分析原因可能是，慢病毒載體介導的hβD-3基因轉染可整合入宿主染色體，在細胞內穩定持久表達。hβD-3表達后分子帶正電荷可利用靜電作用與帶負電荷的細菌胞膜結合，疏水區形成多個通道，破壞胞膜造成胞外的離子等流入胞內，胞內重要成分外流，最終致使細菌死亡。研究[14]發現,hβD-3基因轉染處理大鼠牙周膜細胞，可降低牙周炎大鼠組織破壞，減輕牙周組織炎癥。另一研究[15]發現，慢病毒轉染人β-防御素后，可顯著抑制角質形成細胞的促炎因子表達，亦可抑制牙周炎主要致病微生物的增殖。

綜上所述，經hβD-3基因的慢病毒載體轉染hADSCs, 細胞可正常傳代生長，誘導成骨分化，轉染后的hADSCs對葡萄球菌、卟啉單胞菌均有較好的抗菌活性，抑菌圈隨著細胞濃度升高而增大，可為治療難治性牙周病提供新的治療手段。