木犀草素對結腸癌細胞生長的影響及作用機制研究

楊 悌, 張代玲, 萬啟軍, 張 穎, 高玉錄

(江蘇省昆山市中醫院 檢驗科, 江蘇 昆山, 215300)

結腸癌是全球范圍內最常見的惡性腫瘤之一，其發病率和病死率均呈逐年上升趨勢，嚴重危害患者的健康與生命安全[1]。手術治療仍是結腸癌的主要治療手段，而放療、化療等輔助治療方法可進一步改善患者預后，但結腸癌晚期復發及遠處轉移患者的治療效果不佳，易導致預后不良[2]。木犀草素是一種天然黃酮類化合物，具有抗氧化、抗炎等活性，能抑制多種腫瘤細胞增殖并促進腫瘤細胞凋亡，可用作放療、化療患者的輔助藥物，增敏腫瘤細胞對相關治療的敏感性[3-4]。目前，關于木犀草素對免疫細胞影響的研究較少，木犀草素是否通過影響免疫細胞活性進而參與腫瘤生長抑制尚未明確。本研究以人和小鼠結腸癌細胞系以及小鼠荷瘤模型為研究對象，探討木犀草素對免疫細胞活性和結腸癌細胞生長的影響，現報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與細胞系

8～10周齡雌性C57BL6小鼠，購自南京大學模式動物研究所; 小鼠結腸癌細胞系MC-38、CT-26、CMT-93, 人結腸癌細胞系Caco-2, 均購自中科院上海細胞庫。所有體外培養細胞均在RPMI 1640或DMEM培養基(含10%胎牛血清及青鏈霉素)中于37 ℃、5%CO2濕潤環境培養。

1.2 實驗材料

細胞增殖檢測CCK-8試劑盒，細胞分裂檢測試劑羧基二乙酸熒光素-琥珀酰亞胺酯(CFSE)，細胞凋亡檢測試劑盒(AnnexinV-PI), 乳酸脫氫酶(LDH)釋放檢測試劑盒，均購自北京索萊寶科技有限公司，試劑盒使用方法均參照試劑盒說明書。

1.3 結腸癌細胞增殖、凋亡、遷移檢測方法

將小鼠和人結腸癌細胞培養至對數期，分別于96孔板中鋪板(每孔104個細胞)，分別加入不同濃度木犀草素(1、5、10、20 μmol/L)并設置溶劑對照(0 μmol/L)后于培養箱中培養24 h。CCK-8細胞增殖實驗: 直接向培養體系中加入CCK-8細胞增殖檢測試劑繼續培養4 h后，于波長490 nm處檢測光密度(OD)值。細胞凋亡實驗: 對培養細胞進行膜聯蛋白V-異硫氰酸熒光素(Annexin V-FITC)和碘化丙啶(PI)染色后以流式細胞儀檢測細胞凋亡率，其中5-氟尿嘧啶(5-FU)為細胞凋亡誘導陽性對照。CFSE細胞分裂能力檢測實驗: 首先對培養細胞進行CFSE標記，加入不同濃度木犀草素后于培養箱中培養24 h, 采用流式細胞儀檢測CFSE熒光強度變化。細胞遷移能力(劃痕實驗)檢測: 將細胞培養至對數期后鋪于6孔板中(每孔106個細胞)，待細胞完全鋪滿板底后對細胞進行劃線，以培養基沖洗細胞去除懸浮細胞后加入不同濃度木犀草素后于培養箱中培養24 h, 分別于0、24 h時點觀察劃痕匯合情況。

1.4 小鼠荷瘤模型構建及實驗方法

將小鼠結腸癌細胞系MC-38培養至對數期，細胞計數后于每只小鼠背部皮下接種106個細胞，構建小鼠荷瘤模型。木犀草素組6只小鼠接受腹腔注射木犀草素20 mg/kg治療(每2 d注射1次)，對照組6只小鼠接受相同劑量溶劑注射干預(每2 d注射1次)。待小鼠成瘤后，測量小鼠腫瘤大小，并計算腫瘤體積(計算公式為體積=長×寬2/2), 繪制腫瘤生長曲線。于成瘤后21d解剖小鼠，取腫瘤組織進行稱重。小鼠存活實驗(每組5只小鼠)成瘤方法同上，每天觀察記錄小鼠腫瘤生長及其存活狀況，繪制小鼠存活曲線。

1.5 流式細胞術檢測方法

抗小鼠熒光抗體CD3(17A2)、CD8(53-6.7)、CD4(GK1.5)、NKG2D(CX5)、NK1.1(PK136)、CD69(H1.2F3), 抗人熒光抗體CD8(OKT8)、NKG2D(1D11)、CD69(FN50), 細胞內因子檢測及破膜染色試劑盒，細胞激活劑均購自ThermoFisher公司。將小鼠脾臟單細胞懸液或人外周血單個核細胞(PBMC)分別以不同濃度木犀草素(0、1、5、10、20 μmol/L)刺激24 h, 加入相應熒光抗體, 4 ℃染色30 min后，采用BD FACSVerse流式細胞儀檢測并進行數據分析。

1.6 細胞殺傷活性檢測方法

將CD8+T細胞和自然殺傷(NK)細胞分別與靶細胞(MC-38)以3∶1、1∶1、1∶3比例混合共培養，于共培養體系中加入不同濃度(0、5、10 μmol/L)木犀草素和高爾基體轉運阻斷劑后于培養箱培養4.5 h。分別加入相應熒光抗體(CD8-CD107a、NK1.1-CD107a), 4 ℃染色30 min后，采用BD FACSVerse流式細胞儀檢測并進行數據分析。

1.7 統計學分析

2 結 果

2.1 木犀草素對結腸癌細胞系的影響

CCK-8法檢測結果顯示，與0 μmol/L木犀草素比較，小鼠結腸癌細胞系MC-38、CMT-93的OD490 nm在10、20 μmol/L木犀草素作用下均降低，小鼠結腸癌細胞系CT-26的OD490 nm在5、10、20 μmol/L木犀草素作用下均降低，人結腸癌細胞系Caco-2的OD490 nm在20 μmol/L木犀草素作用下降低，差異有統計學意義(P<0.05或P<0.01), 見圖1。由此表明，木犀草素在5 μmol/L濃度下即可顯著抑制小鼠結腸癌細胞系CT-26增殖, 10 μmol/L濃度即可顯著抑制小鼠結腸癌細胞系MC-38、CMT-93增殖。

A: 小鼠結腸癌細胞系MC-38; B: 小鼠結腸癌細胞系CT-26; C: 小鼠結腸癌細胞系CMT-39; D: 人結腸癌細胞系Caco-2。與0 μmol/L比較, *P<0.05, **P<0.01。圖1 不同濃度(0、1、5、10、20 μmol/L)木犀草素對結腸癌細胞系增殖的影響

CFSE細胞分裂能力檢測實驗結果顯示, 5、10、20 μmol/L木犀草素作用下的分裂細胞百分率均低于0 μmol/L木犀草素，差異有統計學意義(P<0.01), 見圖2, 表明木犀草素可顯著抑制小鼠結腸癌細胞系CT-26分裂，且呈濃度依賴性。

A: CFSE檢測不同濃度木犀草素對小鼠結腸癌細胞系CT-26分裂的影響; B: 分裂細胞百分率統計結果(與0 μmol/L比較, **P<0.01)。圖2 不同濃度(0、1、5、10、20 μmol/L)木犀草素對結腸癌細胞分裂的影響

小鼠結腸癌細胞系CT-26凋亡實驗結果顯示，隨著木犀草素濃度的升高，凋亡細胞百分率升高，差異有統計學意義(P<0.05或P<0.01), 見圖3, 表明木犀草素可促進結腸癌細胞的凋亡。

A: 流式細胞術檢測不同濃度木犀草素對小鼠結腸癌細胞系CT-26凋亡的影響(5-FU為細胞凋亡誘導陽性對照); B: 凋亡細胞百分率結果(與0 μmol/L比較, *P<0.05, **P<0.01)。圖3 不同濃度(0、1、5、10、20 μmol/L)木犀草素對結腸癌細胞凋亡的影響

細胞劃痕實驗結果顯示，木犀草素可顯著抑制小鼠結腸癌細胞系MC-38的遷移能力，見圖4。

圖4 細胞劃痕實驗檢測不同濃度木犀草素對小鼠結腸癌細胞系MC-38遷移的影響

2.2 木犀草素治療對小鼠移植瘤生長的影響

構建小鼠結腸癌細胞系MC-38移植瘤模型探討木犀草素治療對腫瘤生長的影響，結果顯示，木犀草素組荷瘤小鼠成瘤21 d的腫瘤體積與腫瘤質量均大于對照組，差異有統計學意義(P<0.01), 且木犀草素組小鼠的生存率高于對照組，差異有統計學意義(P<0.05), 見圖5。由此表明，木犀草素治療可顯著抑制小鼠MC-38結腸癌移植瘤的生長，并可延長小鼠的生存期。

A: 2組荷瘤小鼠腫瘤生長曲線(n=6); B: 2組荷瘤小鼠腫瘤組織質量(n=6); C: 2組荷瘤小鼠生存曲線(n=5)。2組間比較, *P<0.05, **P<0.01。圖5 小鼠結腸癌細胞系MC-38荷瘤小鼠模型腫瘤生長及生存曲線

2.3 木犀草素對小鼠免疫細胞活性的影響

為探索木犀草素對免疫細胞活性的影響，本研究采用不同濃度木犀草素體外刺激小鼠免疫細胞，觀察小鼠脾臟淋巴細胞增殖及表面活化分子表達情況。結果顯示，1、5、10、20 μmol/L木犀草素對小鼠淋巴細胞增殖均有抑制效應，但與0 μmol/L木犀草素比較，差異無統計學意義(P>0.05), 見圖6; 不同濃度木犀草素對CD4+T細胞、CD8+T細胞表面活化型分子CD69表達的影響比較，差異無統計學意義(P>0.05), 說明木犀草素對小鼠淋巴細胞活化無直接影響; 相較于0 μmol/L木犀草素，1、5、10、20 μmol/L木犀草素均使CD8+T細胞、NK細胞表面NKG2D表達上調，差異有統計學意義(P<0.05或P<0.01), 見圖7, 提示木犀草素可能上調CD8+T細胞和NK細胞對腫瘤的殺傷能力。進一步采用LDH釋放法檢測小鼠CD8+T細胞和NK細胞經木犀草素刺激后對MC-38、Yac-1細胞的殺傷能力，結果顯示，當效靶比為3∶1時，相較于0 μmol/L木犀草素, 10 μmol/L木犀草素可上調CD8+T細胞和NK細胞對靶細胞的殺傷活性，差異有統計學意義(P<0.05), 見圖8。

圖6 不同濃度木犀草素對小鼠脾臟細胞增殖的影響

A: CD4+T細胞、CD8+T細胞表面CD69表達; B: CD8+T細胞、NK細胞表面NKG2D表達; C: 細胞表面分子表達頻率統計結果(與0 μmol/L比較, *P<0.05, **P<0.01)。圖7 不同濃度木犀草素對小鼠脾臟細胞表面分子表達的影響

A: CD8+T細胞殺傷能力檢測; B: NK細胞殺傷能力檢測。與0 μmol/L比較, *P<0.05。圖8 木犀草素對小鼠脾臟CD8+T細胞和NK細胞殺傷能力的影響

2.4 木犀草素對人T細胞活化的影響

為明確木犀草素對人外周血淋巴細胞活性的影響，本研究分離健康個體PBMC, 在體外以不同濃度木犀草素處理后檢測CD8+T細胞表面活化分子CD69、NKG2D表達情況。結果顯示，相較于0 μmol/L木犀草素，1、5、10、20 μmol/L木犀草素體外刺激均可上調人外周血CD8+T細胞表面CD69、NKG2D表達，差異有統計學意義(P<0.05或P<0.01), 見圖9。

A: CD8+T細胞表面CD69、NKG2D分子表達情況; B: 陽性細胞百分率統計結果(與0 μmol/L比較, *P<0.05, **P<0.01)。圖9 不同濃度木犀草素對人外周血CD8+T細胞表面活化分子表達的影響

3 討 論

木犀草素具有抑制腫瘤細胞增殖、誘導腫瘤細胞凋亡和干擾腫瘤代謝的能力[5-6]。本研究分析了不同濃度木犀草素對人和小鼠結腸癌細胞系增殖、凋亡的影響，發現木犀草素可抑制多種結腸癌細胞系的增殖，并可促進結腸癌細胞凋亡，但在不同結腸癌細胞系中，木犀草素抑制細胞增殖的效應存在差異，說明不同結腸癌細胞對木犀草素的敏感性可能不同。

NK細胞是抗腫瘤免疫的第一道防線，而CD8+T細胞是抗腫瘤免疫應答的核心環節[7], 其中NKG2D對固有免疫和獲得性免疫均具有調控作用，是抗腫瘤免疫應答的活化型受體，其在免疫細胞的表達情況受到臨床廣泛關注[8-9]。本研究檢測木犀草素對小鼠、人T細胞與NK細胞表面活化型分子CD69、NKG2D的影響結果發現，木犀草素對免疫細胞增殖及活化無影響，但可顯著上調CD8+T細胞及NK細胞表面NKG2D表達，提示木犀草素的抗腫瘤效應可能與激活免疫細胞對腫瘤細胞的殺傷能力相關。相關報道[10]顯示，多種天然黃酮類化合物可通過影響免疫細胞的活性參與腫瘤等相關疾病的發生與進展，因此，深入探討木犀草素對免疫細胞活性及功能的影響，可為進一步研究木犀草素在臨床相關疾病治療中的作用機制提供理論依據。

綜上所述，木犀草素可抑制結腸癌細胞生長，促進結腸癌細胞凋亡，抑制移植瘤生長，延長荷瘤小鼠的生存期，還可增強免疫細胞活性而抑制腫瘤生長。