黔東南三地大葉韭菜總黃酮含量及抗氧化活性研究

胡秀虹，龍杰鳳，楊勝舟，萬蘭，張海蘭，王曉銘

（凱里學院，貴州凱里 556011）

韭菜Allium tuberosum屬百合科多年生草本植物，味辛、性溫，有溫中行氣、補虛益陽、散瘀解毒之功效，是中國特有的一種藥食同源的蔬菜［1-3］.研究表明，韭菜中含硫化物、生物堿、揮發油、黃酮類化合物等多種活性成分［4-6］.大量研究表明［5，7-9］，黃酮類化合物具有抗氧化活性，可用于食品的防腐保鮮［9-10］，還能抑制細胞的凋亡，是治療心血管疾病藥物的主要成分［4，11-12］.

近年來關于韭菜的化學成分、藥理學方面的研究較為深入，對于總黃酮的提取及抗氧化性雖有研究，但多數是韭菜籽方面的報道.如孫志勇等對韭菜葉及韭菜籽醇提物進行了抗氧化活性研究，結果顯示韭菜籽及韭菜葉醇提液對DPPH·自由基有很好的清除能力［13］.黃鎖義等發現，韭菜的黃酮提取物對羥自由基具有很好的清除作用［7］.郭奎彩等［8］研究表明，韭菜籽總黃酮有較強的體外抗氧化作用，能夠有效清除DPPH·和·OH，其IC50分別為0.87 μg/mL和3.33 μg/mL.李敬等研究發現，韭菜籽總黃酮對DPPH·和·OH 均具有一定的清除作用，最高清除率分別為82.36%和61.20%［9］.

基于此，本文以黔東南苗族侗族自治州麻江、施秉及丹寨三地的大葉韭菜為研究對象，分析比較其總黃酮的含量差異以及不同部位（根和葉）總黃酮含量的區別，并進一步探究三個地區的大葉韭菜總黃酮的抗氧化活性，旨在為貴州黔東南州大葉韭菜資源的利用以及天然抗氧化劑的開發提供科學依據.

1 實驗材料、試劑與儀器

1.1 實驗材料與試劑

實驗材料大葉韭菜采集于貴州省黔東南州麻江縣大葉韭菜種植基地、丹寨縣農貿市場和施秉縣農貿市場.

實驗試劑有蘆丁（C≥0.97）、維生素C（C≥0.99）、1，1-二苯肼-2-三硝基苯肼（1，1-Diphenyl-2-picylhydrazyl，DPPH，C≥0.94），上海源葉生物科技有限公司；亞硝酸鈉、冰醋酸、氫氧化鋁、三氯化鋁、硫酸亞鐵，重慶川江化學試劑廠；無水乙醇、無水醋酸鈉、過氧化氫、水楊酸，成都金山化學試劑有限公司.

1.2 實驗儀器

實驗儀器包括UP-6T 優普超UP-6T 型超聲波清洗機，上海優普實業有限公司；XFB-500新型密封式粉碎機，吉首市中誠制藥機械廠；FA2004 電子天平，上海舜宇恒平科學儀器有限公司；WGLL-230BE電熱恒溫鼓風干燥箱，天津市泰斯特儀器有限公司；BIO-BRI酶標儀，成都百樂科技有限公司；BIO-BRI暗箱三用紫外線分析儀，上海嘉鵬科技有限公司；BCD-241TMCN冰箱，青島海爾股份有限公司.

2 實驗方法

2.1 大葉韭菜的前處理

將采集的新鮮大葉韭菜洗凈，根、葉分離，分別置于電熱恒溫干燥箱中45 ℃烘干，粉碎，過60目篩，裝入密封袋，置于干燥器中備用.

2.2 蘆丁標準曲線繪制

取5 支試管，按表1 的取量精密量取0.2 mg/mL 蘆丁標準溶液，依次加入0.1 mol/L AlCl3溶液和pH 為4.8 的HAc -NaAc 緩沖溶液，60%乙醇溶液定容，搖勻.以60%乙醇溶液作為參比，于40℃水浴反應10 min，在407 nm 波長下測定吸光度值，以蘆丁溶液濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制標準曲線圖.

表1 蘆丁標準稀釋溶液的配制

2.3 大葉韭菜總黃酮含量測定

稱取大葉韭菜粉末4 g，加80 mL 60%乙醇，超聲波提取30 min，抽濾.濾渣相同條件下二次提取，合并兩次濾液，保存備用.取提取液1 mL，按照2.2 操作，測定其吸光度，代入標準曲線方程得總黃酮濃度，按公式計算總黃酮得率：總黃酮得率（mg/g）=CV/m.式中C為按標準曲線計算的溶液的總黃酮濃度（mg/mL），V為提取液的體積（mL），m為原料質量（4.0316 g）.

2.4 大葉韭菜總黃酮的薄層層析

在硅膠G薄層板鑒別大葉韭菜黃酮類化合物的存在，以乙酸乙酯∶甲醇∶水（8∶3∶1）作為展開劑，以1%AlCl3溶液作為顯色劑于紫外燈下觀察其熒光位置.

2.5 大葉韭菜總黃酮抗氧化活性測定

2.5.1 清除DPPH·自由基能力測定

DPPH 分子式為（H6H5）2·N-NC6H2（NO2）3，是一種很穩定的氮中心自由基，其無水乙醇溶液呈紫色，在517 nm 波長處有最大吸收峰，吸光度與濃度呈線性關系.當加入自由基清除劑時，可結合或替代DPPH·，使自由基數量減少，吸光度變小，溶液顏色變淺，借此可評價清除自由基的能力.一般清除率越大，抗氧化活性越強.研究表明，黃酮類化合物因含有酚羥基，能與DPPH 反應而清除自由基［9，14-15］.

實驗時，按照表2 順序加樣，混勻，超聲處理10 min，于25 ℃水浴恒溫反應20 min，無水乙醇凋零，于517 nm 處測定各體系的吸光度A，平行實驗3次，根據吸光度計算DPPH·自由基清除率，公式如下：DPPH·清除率（%）=［（A2+A3-A1］/A2×100%.式中A1、A2、A3分別為1、2、3反應體系反應結束后，517 nm處的吸光度.

表2 清除DPPH自由基的反應體系

2.5.2 黃酮清除羥基自由基能力測定

羥基自由基（·OH）清除率是反映藥物抗氧化作用的重要指標，采用Fenton 反應，利用H2O2與Fe2+混合產生·OH，加入水楊酸捕捉·OH 自由基并產生有色物質2，3-二羥基苯甲酸，該物質在510 nm 處有最大吸收.當向該反應體系中加入具有清除·OH 供能的物質，就會減少·OH 的生成，從而使有色物質的生成量減少，即溶液的A510nm值降低［7，16］.

實驗時，參照表3依次在比色管中加入相應溶液.在510 nm 處測定各反應溶液的吸光度，代入如下公式計算羥自由基的清除率：羥自由基清除率（%）=A0-（Ax-Ax0）/A0×100.式中A0為空白對照的吸光度，Ax為樣品溶液的吸光度；Ax0為不加顯色劑（H2O2）的吸光度.

表3 清除羥自由基的反應體系

3 結果與分析

3.1 蘆丁溶液標準曲線

蘆丁溶液標準曲線如圖1所示，由蘆丁標準曲線圖可得標準曲線方程為：y=10.083x+0.137 9，R2=0.998 1，線性關系良好.

圖1 蘆丁溶液標準曲線

3.2 不同地區大葉韭菜總黃酮的含量

表4 是在黔東南麻江縣、丹寨縣及施秉縣三個地區于不同時期采集的大葉韭菜總黃酮的含量測定結果.由表4 可知，麻江縣大葉韭菜葉總黃酮含量均值為6.821～7.215 mg/g，根的為0.485～0.534 mg/g；丹寨縣大葉韭菜葉總黃酮含量均值為6.416～7.049 mg/g，根的為0.361～0.403 mg/g；施秉縣大葉韭菜葉總黃酮含量均值為6.184～7.009 mg/g，根的為0.281～0.339 mg/g.分析實驗結果發現，同一地區的大葉韭菜不同部位（根、葉）的總黃酮含量差別較大，其中韭菜葉總黃酮含量遠大于根所含總黃酮含量.而不同生長時期的大葉韭菜同一部位的總黃酮含量差別較小，且不同地區的大葉韭菜同一部位的總黃酮含量無顯著差異.

表4 不同地區韭菜總黃酮含量

3.3 大葉韭菜總黃酮的鑒別結果

圖2 為大葉韭菜總黃酮提取液的薄層層析鑒別結果，圖中點樣從左往右分別為蘆丁標準溶液（1號）、高濃度韭菜提取液（2號）及低濃度韭菜提取液（3號）.由圖2可知，三個樣品在薄層板上近同一位置均顯示有相同顏色的斑點.這說明大葉韭菜提取液中含有黃酮類化合物，隨著濃度的升高，斑點顏色越深.此外，相對蘆丁標準溶液，2、3號樣品的斑點具有明顯的拖尾現象，這主要是因為粗取液可能含有其他類化合物造成.

圖2 韭菜總黃酮的薄層層析圖

3.4 不同地區大葉韭菜總黃酮清除DPPH·自由基的能力

圖3 為黔東南麻江縣、丹寨縣及施秉縣三個地區的大葉韭菜（葉）總黃酮提取液對DPPH·自由基的清除率結果.可以看出，三地韭菜葉總黃酮提取液對DPPH·自由基均有較強的清除能力，隨著濃度的增加，對DPPH·自由基的清除能力逐漸增強，在接近0.01～0.05 mg/mL 時，其DPPH·清除率分別為40.12%～82.15%、36.85%～79.25%和32.58%～75.39%，DPPH·清除率大小順序為麻江＞丹寨＞施秉.

圖3 三地大葉韭菜（葉）總黃酮提取液對DPPH·的清除率

圖4 是三個地區的大葉韭菜（根）總黃酮提取液對DPPH·的清除率.由圖4 可知，0.01～0.03 mg/L 時，韭菜根總黃酮提取液對DPPH·自由基的清除率很小，隨著濃度逐漸增大，清除率逐漸增大，最大清除率分別為（麻江）37.13%、（丹寨）30.58%、（施秉）23.17%.

圖4 三地大葉韭菜（根）總黃酮提取液對DPPH·的清除率

3.5 不同地區大葉韭菜總黃酮清除·OH自由基的能力

圖5 是三個地區的大葉韭菜（葉）總黃酮提取液對·OH 的清除率.實驗結果顯示，三個地區的大葉韭菜葉對·OH 自由基的清除能力在0.01～0.05 mg/mL 時，隨著黃酮濃度的增加而增強，其·OH清除率分別為：38.50%～79.17%（麻江）、28.13%～76.13%（丹寨）和26.63%～74.13%（施秉）.

圖5 三地大葉韭菜（葉）總黃酮提取液對·OH的清除率

圖6 為韭菜根對·OH 自由基的清除能力，由圖可知在濃度為0.01～0.06 mg/mL 時，隨著韭菜總黃酮濃度增大，三個地區韭菜根對·OH 的清除能力隨著增強，·OH 清除率最大的是麻江（56.25%），其次是丹寨（48.35%）和施秉韭菜根（45.68%）.

圖6 三地大葉韭菜（根）總黃酮提取液對·OH的清除率

4 結論與討論

本研究通過測定分析黔東南三個地區的大葉韭菜及其不同部位總黃酮含量，得出同一地區的大葉韭菜不同部位（根、葉）的總黃酮含量差別較大，其中韭菜葉所含總黃酮含量遠遠大于韭菜根所含總黃酮含量.而不同生長時期的大葉韭菜同一部位的總黃酮含量差別較小，且不同地區的大葉韭菜同一部位的總黃酮含量無顯著差異.實驗數據顯示，麻江的韭菜葉總黃酮含量均值為6.821～7.215 mg/g，根的為0.485～0.534 mg/g；丹寨的韭菜葉總黃酮含量均值為6.416～7.049 mg/g，根的為0.361～0.403 mg/g；施秉的韭菜葉總黃酮含量均值為6.184～7.009 mg/g；根的為0.281～0.339 mg/g.據劉華等［17］報道，采自安順市的細葉韭菜和韭總黃酮含量分別為3.68 mg/g 和0.53 mg/g，與本研究結果有一定的差別。這說明不同品種韭菜，總黃酮含量也有較大區別.

此外，研究發現，大葉韭菜（根、葉）總黃酮提取液對DPPH·和·OH 有一定的清除作用.在接近0.01～0.05 mg/mL 內，其清除率隨著提取液總黃酮濃度的增加而增大，反映了其抗氧化能力與總黃酮濃度有關.實驗數據表明，黔東南麻江、丹寨和施秉3 個地區的大葉韭菜（葉）對DPPH·的清除率可高達75.39%～82.15%，對·OH 的最大清除率為74.13%～79.17%；韭菜根對DPPH·的清除率可高達23.17%～37.13%，對·OH 的最大清除率為45.68%～56.25%.這與相關報道基本吻合［7，11，15］.由此可見，大葉韭菜總黃酮作為一種天然、安全的植物提取物，在食品方面，不僅可作為抗氧化劑、防腐劑等食品添加劑開發利用，也可應用于具有抗氧化及抗衰老作用的功能性食品的研發；在醫藥方面，可應用于抗菌消炎、止咳平喘、抗腫瘤等藥物當中.