棉花GaLMI1-like基因功能及其啟動子表達分析

楊小貝，陳二永，李成偉

(1.河南科技學院 生命科技學院，河南省糧食作物基因組編輯工程技術研究中心，河南 新鄉 453003；2.河南工業大學 生物工程學院，河南 鄭州 450001)

葉片是農作物的重要器官，在光合產物的積累、氣體交換、養分分配和水分運輸中起著重要的作用[1]。葉片形狀會顯著影響植物的冠層蒸發散熱、日光和化學農藥的滲透、害蟲的喜好以及作物的最終產量和質量[2]。葉形的多樣性反映了自然選擇對葉片功能的篩選作用，不同葉形是了解其生態學、進化驅動力及其功能意義的寶貴資源[3]。通過改變作物葉形而創制出農藝性狀優良的作物新品種是農作物育種需要關注的一個重要方向[4]。

棉花是世界上重要的纖維作物和油料作物，棉纖維大量應用于紡織工業。我國作為棉花生產大國，棉花及其紡織產品在我國國民經濟中占有較大比例。棉花是喜光作物，在光照充足的條件下長勢較好，光照也是影響棉花植株生長發育和纖維品質優劣的重要條件之一[5]。葉片作為重要的光合器官，葉片形態在棉花品種之間存在顯著的表型差異，自然界的棉花擁有如鋸齒形、淺裂形、雞腳形、楓葉形等不同葉形。棉花葉形是影響其冠層結構、產量、耐逆性和其他生產相關屬性的重要農藝性狀[6]。

現有研究發現，一些基因在葉形發育中起著關鍵作用。SlLAX1可以平衡葉片近軸和遠軸細胞的生長，其突變可引起葉片卷曲表型[7]。ELI-A調控大麥葉舌的發育，ELI-A突變會引起葉鞘邊緣發育異常，產生無葉舌的葉片[8]。在擬南芥中過表達BRH1基因可改變葉型，降低葉片的長寬比[9]。AfLFY在煙草中過表達可以調控葉片發育，使其由圓形轉變為橢圓形[10]。除了基因可調控葉片發育外，miRNA對葉片發育也有顯著影響，如miRNA160單突變體擬南芥在14 d時葉片為鋸齒狀，同樣大小的miRNA165/166突變體葉片為圓形[11]。KNOX1(Class IKNOTTED1-LIKEHOMEOBOX)調控著莖頂端分生組織 (SAM)的形成和維持。KNOX1功能的維持通過其在單葉植物和復葉植物的SAM及葉原基的表達模式差異實現[12]。另一個KNOX1基因SHOOTMERISTEMLESS對葉開裂的形成是十分必要的，在擬南芥中缺失該基因會形成不開裂葉片[13]。杯狀子葉基因CUC1、CUC2和CUC3參與胚胎頂端分生組織的形成和子葉邊界的特化[14]。CUC2對鋸齒狀葉的發育起始是必要的，而CUC3參與葉片鋸齒狀的維持[15]。進一步研究發現，在擬南芥中MIR164A與CUC2協同調控葉緣的鋸齒狀表型[16]。LMI1(LATEMERISTEMIDENTITY1)基因是擬南芥中形成簡單鋸齒狀葉片所必需的基因，而LMI1基因的缺失導致了苞片的形成[17]。在十字花科中有3種LMI1-like基因，它們的過表達可以改變擬南芥的葉形和產生深裂葉片[18]。BnA10.LMI1正向調控甘藍型油菜裂片葉的發育[19]。在棉花中，利用基因定位獲得一個LMI1同源基因，該基因同樣編碼一個HD-Zip轉錄因子，被命名為GhLMI1-D1b，其是棉花葉片形狀變化的主要決定因素，將該基因沉默后可誘導葉片從雞腳葉向淺裂葉的轉變[20]。LMI1基因在種子植物中是保守的[21]，其在葉形發育中的功能研究非常值得被關注，這些研究為培育理想葉形的農作物新品種提供了堅實的理論基礎。

LMI1基因是控制葉形發育的關鍵基因，但是其同源基因是否均具有調節葉形的功能，以及該基因及其同源基因如何被調控而造成自然界葉形多樣性的，目前依然知之甚少。植物形態多樣性通常是由發育基因的順式調節差異和相應的時空表達來調控的[22-23]。順式調節的差異主要展現在啟動子的差異上，因此，研究LMI1同源基因的功能及分析LMI1同源基因的啟動子活性對理解LMI1同源基因調控植物葉形的機理具有十分重要的意義。

本研究以具有雞腳葉表型的亞洲棉石溪亞1號為試驗材料，通過特異性引物克隆獲得GaLMI1-like基因序列和其啟動子序列，構建GaLMI1-like基因過表達載體p6MYC-GaLMI1-like并通過農桿菌介導的蘸花法轉化模式植物擬南芥，以驗證GaLMI1-like是否具有調控葉形發育的功能。同時，對GaLMI1-like基因啟動子序列進行順式作用元件分析，構建GaLMI1-like啟動子GUS表達載體pCAMBIA1391-pGaLMI1-like并轉化模式植物擬南芥，經GUS染色分析GaLMI1-like啟動子驅動基因表達的模式，為理解GaLMI1-like基因及其啟動子在調控棉花葉形方面的功能機制和培育理想株型的棉花提供理論基礎。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

1.1.1 植物材料 供試材料亞洲棉(Gossypiumarboretum)石溪亞1號、擬南芥 (Arabidopsisthaliana)哥倫比亞型 (Columbia-0，Col-0)均由河南科技學院生命科技學院河南省糧食作物基因組編輯工程技術研究中心保存。

1.1.2 菌株與載體 大腸桿菌(Escherichiacoli)DH5α和農桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)GV3101菌株購自上海唯地生物技術有限公司；克隆載體質粒pMDTM19-T Vector購自寶生物工程(大連)有限公司；過表達載體質粒p6MYC與啟動子GUS表達載體質粒pCAMBIA1391均為河南省糧食作物基因組編輯工程技術研究中心保存。

1.1.3 酶和化學試劑 限制性內切酶 QuickCutTMKpnⅠ、QuickCutTMSpeⅠ、QuickCutTMHind Ⅲ和QuickCutTMBamH Ⅰ、高保真酶PrimeSTAR?GXL DNA Polymerase均購自寶生物工程(大連)有限公司；BM2000、BM2000+與BM5000+DNA Marker購自北京博邁德基因技術有限公司；DNA凝膠回收試劑盒及質粒小量抽提試劑盒均購自天根生化科技(北京)有限公司；GUS染色試劑盒購自北京華越洋生物科技有限公司；引物由武漢金開瑞生物工程有限公司合成。其余化學試劑均為國產分析純。

1.2 試驗方法

1.2.1 棉花和擬南芥DNA的提取 取亞洲棉石溪亞1號三葉期葉片或者移栽后20 d左右的Col-0擬南芥葉片，放置于研缽中并經液氮冷凍后用研磨棒磨成粉末，依據說明書使用新型快速植物基因組DNA提取試劑盒(百泰克生物技術有限公司，DP3112)進行DNA提取，用于后續GaLMI1-like基因啟動子(簡稱pGaLMI1-like)的擴增或轉基因擬南芥陽性植株的鑒定。

1.2.2 棉花和擬南芥RNA的提取及cDNA的合成 取亞洲棉石溪亞1號三葉期葉片或生長21 d的Col-0與GaLMI1-like轉基因擬南芥葉片，液氮冷凍后研磨成粉末，使用RNAprep Pure 多糖多酚植物總RNA 提取試劑盒(天根生化科技(北京)有限公司，DP441)提取上述組織的總RNA。RNA提取完成后立即使用PrimeScript?RT Reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time)(TaKaRa，RR047A)合成cDNA，用于GaLMI1-like基因的克隆或者檢測GaLMI1-like轉基因擬南芥是否為陽性植株。

1.2.3GaLMI1-like基因及GaLMI1-like啟動子的擴增 以擬南芥LMI1蛋白序列為參考，在棉花基因組網站COTTONGEN(https：//www.cottongen.org/)中利用BlastP同源搜索其在亞洲棉中的同源基因，將與LMI1相似性最大的基因命名為GaLMI1-like。分別以在棉花基因組中檢索到的GaLMI1-like基因及GaLMI1-like啟動子序列為參考，利用 Primer Premier 6 軟件設計以下引物。GaLMI1-like基因過表達擴增引物為GaLMI1-like-F：5′-GGTACCTATGGATTGGAATGGCACCATT-3′，下劃線為酶切位點KpnⅠ；GaLMI1-like-R：5′-ACTAGTTTAGGGATAAGAAGGGAGTTG-3′，下劃線為酶切位點SpeⅠ。GaLMI1-like啟動子擴增引物序列為pGaLMI1-like-F：5′-AAGCTTACACTCTGCAATCTGCATGAA-3′，下劃線表示酶切位點Hind Ⅲ；pGaLMI1-like-R：5′-GGATCCTTTTCTTTGAATAAAGAAAGCGA-3′，下劃線表示酶切位點BamH Ⅰ。以從石溪亞1號棉花提取RNA后反轉錄獲得的cDNA為模板PCR擴增GaLMI1-like基因，同時，以棉花石溪亞1號DNA為模板PCR擴增GaLMI1-like啟動子序列。擴增反應體系(20 μL體系)：PrimeSTAR?GXL DNA Polymerase 0.2 μL；5×PrimeSTAR GXL Buffer 4 μL；cDNA/DNA 1 μL；GaLMI1-like-F/pGaLMI1-like-F(10 μmol/L)0.5 μL；GaLMI1-like-R/pGaLMI1-like-R(10 μmol/L)0.5 μL；2.5 mmol/L dNTPs 2 μL；ddH2O 11.8 μL。PCR反應程序：98 ℃預變性5 min；98 ℃變性30 s，56 ℃ 退火30 s，72 ℃延伸45 s，30個循環；72 ℃繼續延伸10 min，4 ℃保存。PCR反應結束后將上述2種PCR反應產物加入新制的1.5%瓊脂糖凝膠中。使用電壓120 V、電流150 A進行瓊脂糖凝膠電泳，運行時長15 min；然后置于瓊脂糖凝膠成像儀中進行觀測，PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳檢測正確的條帶進行切膠處理，用瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收純化目的片段，得到的目的片段進行加A反應后連接到測序載體pMDTM19-T上，構建pMDTM19-T-GaLMI1-like和pMDTM19-T-pGaLMI1-like，分別轉化大腸桿菌感受態DH5α并涂布含有氨芐青霉素(50 μg/mL)的LB平板，待長出菌斑后挑取單克隆菌落進行PCR驗證，經瓊脂糖凝膠電泳檢測含有正確目的條帶的單菌落進行搖菌培養，之后將菌液送至武漢金開瑞公司進行測序。

1.2.4GaLMI1-like過表達載體及GaLMI1-like啟動子GUS表達載體的構建 使用QuickCutTMKpnⅠ和QuickCutTMSpeⅠ酶切pMDTM19-T-GaLMI1-like重組載體，利用QuickCutTMHind Ⅲ和QuickCutTMBamH Ⅰ酶切pMDTM19-T-pGaLMI1-like重組載體，瓊脂糖凝膠分離并分別回收GaLMI1-like基因和GaLMI1-like啟動子片段。將GaLMI1-like基因與經QuickCutTMKpnⅠ和QuickCutTMSpeⅠ酶切線性化的p6MYC進行連接反應，GaLMI1-like啟動子片段與經QuickCutTMHind Ⅲ和QuickCutTMBamH Ⅰ線性化的pCAMBIA1391載體進行連接重組，之后分別轉化到大腸桿菌感受態細胞DH5α，然后進行菌落PCR鑒定，經瓊脂糖凝膠電泳檢測正確的陽性菌落進行搖菌提取質粒，再次用限制性內切酶QuickCutTMKpnⅠ和QuickCutTMSpeⅠ、QuickCutTMHind Ⅲ和QuickCutTMBamH Ⅰ分別酶切鑒定重組載體p6MYC-GaLMI1-like和pCAMBIA1391-pGaLMI1-like，瓊脂糖凝膠電泳檢測出現大小正確的GaLMI1-like基因和GaLMI1-like啟動子片段后可確認成功得到GaLMI1-like過表達載體p6MYC-GaLMI1-like與GaLMI1-like啟動子GUS載體pCAMBIA1391-pGaLMI1-like。

1.2.5GaLMI1-like啟動子序列分析 運用數據庫New PLACE(https：//www.dna.affrc.go.jp/PLACE/？action=newplace)和PlantCARE(http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)對GaLMI1-like啟動子序列中包含的順式作用元件進行分析。

1.2.6 擬南芥轉化及轉基因擬南芥的鑒定 p6MYC-GaLMI1-like和pCAMBIA1391-pGaLMI1-like轉基因擬南芥T0植株的獲得采用農桿菌介導的蘸花法[24]。收取轉基因擬南芥T0種子，經表面滅菌消毒后均勻地播種在含有潮霉素和頭孢霉素的MS篩選培養基上，大約12 d后將篩選獲得的根系較長且長出2片真葉的T1幼苗移栽至營養土中，置于光照培養箱中培養。為了驗證p6MYC-GaLMI1-like是否成功轉化擬南芥Col-0，提取生長21 d的轉基因擬南芥葉片RNA并轉錄成cDNA，利用半定量PCR法檢測GaLMI1-like基因在轉基因擬南芥中有無上調表達。半定量PCR使用的內參基因為AtUBQ10(At4g05320)，引物序列為AtUBQ10-F：5′-CAGAACTTTGGCCGACTAC-3′，AtUBQ10-R：5′-ATGGTCTTTCCGGTGAGAG-3′。同時，為了檢測是否獲得pCAMBIA1391-pGaLMI1-like轉基因擬南芥陽性植株，待轉基因擬南芥植株在培養箱中生長30 d后，取葉片提取DNA，PCR鑒定轉基因陽性植株。PCR鑒定所使用的引物同載體構建引物，即pGaLMI1-like-F與pGaLMI1-like-R。對PCR鑒定陽性的T1植株進行收種，之后將T1種子點播到含有潮霉素的MS培養基進行抗性篩選以獲得T2幼苗，培養方式同T1，直至收獲T2種子。擬南芥培養條件設置為光周期16 h光照/8 h黑暗、溫度22 ℃(光照)/19 ℃(黑暗)、光照強度12 000 lx、濕度55%[25]。

1.2.7 GUS染色分析 取pCAMBIA1391-pGaLMI1-like轉基因擬南芥種子、剛萌發的種子、萌發3 d和12 d的幼苗、生長30 d的莖生葉、花和角果等組織，依照說明書使用華越洋公司的GUS染色劑進行組織化學染色。脫色后的組織材料使用體視顯微鏡 (AXIO Zoom.V16，Zeiss)進行觀察并拍照記錄。

2 結果與分析

2.1 GaLMI1-like蛋白結構域及進化分析

以擬南芥LMI1蛋白序列為參考，利用BlastP在棉花數據庫COTTONGEN(https：//www.cottongen.org/)中同源搜索其在亞洲棉中的同源基因，將與LMI1同源性最大的同源基因(Cotton_A_00507_BGI-A2_v1.0)命名為GaLMI1-like。利用SMART網站預測GaLMI1-like蛋白的結構域，發現其含有一個homeobox(HOX)結構域(圖1-A)。含有HOX結構域的蛋白質多為DNA結合因子，這類蛋白質主要參與關鍵發育過程的轉錄調節，這預示著GaLMI1-like蛋白在棉花生長發育中發揮重要作用。利用GaLMI1-like蛋白序列在NCBI(https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/)中搜索其同源基因，獲得其在棉花和其他物種的12種同源基因，進一步利用MEGA 6軟件分析GaLMI1-like蛋白與其同源蛋白的進化關系(圖1-B)，結果表明，GaLMI1-like與同物種陸地棉(Gossypiumhirsutum)中登錄號為KAG4215939.1的蛋白質聚在一起，暗示陸地棉中登錄號為KAG4215939.1的蛋白質基因起源于亞洲棉的GaLMI1-like基因。同時結果顯示，GaLMI1-like蛋白與異源物種木槿中登錄號為XP 039051516.1的蛋白質進化關系較近，說明GaLMI1-like蛋白與登錄號為XP 039051516.1的蛋白質具有相似的功能。

A.GaLMI1-like蛋白結構域分析；B.GaLMI1-like及其同源蛋白進化樹分析。A.The domain analysis of GaLMI1-like；B.Phylogenetic tree analysis of GaLMI1-like and its homologous proteins.

2.2GaLMI1-like基因的克隆

以從棉花基因組數據庫COTTONGEN(https://www.cottongen.org/)中獲取的GaLMI1-like基因序列為參考，設計可擴增其編碼區的特異性引物，以從亞洲棉石溪亞1號提取RNA轉錄獲得的cDNA為模板，PCR擴增GaLMI1-like基因，瓊脂糖凝膠電泳顯示，在681 bp左右有一條明亮條帶，與已知GaLMI1-like基因序列大小一致(圖2)。對瓊脂糖凝膠電泳顯示的明亮條帶進行膠回收，與pMDTM19-T載體連接獲得pMDTM19-T-GaLMI1-like重組載體，測序后與GaLMI1-like基因序列進行比對，結果顯示，其與GaLMI1-like基因序列一致，說明成功克隆了GaLMI1-like基因。

M.DNA Marker；1，2.GaLMI1-like基因片段。M.DNA Marker；1，2.GaLMI1-like gene fragment.

2.3 p6MYC-GaLMI1-like載體的構建

為了研究GaLMI1-like基因的功能，設計構建GaLMI1-like的過表達載體。搖菌、提取質粒后利用QuickCutTMKpnⅠ和QuickCutTMSpeⅠ對p6MYC-GaLMI1-like重組載體進行酶切鑒定，結果顯示，重組載體被切割為一條680 bp左右的條帶和一條大于5 000 bp的條帶(圖3)，與預期的GaLMI1-like基因條帶和p6MYC載體條帶大小一致，說明已成功構建GaLMI1-like基因的過表達載體p6MYC-GaLMI1-like，重組載體的結構如圖4所示。通過凍融法將p6MYC-GaLMI1-like載體轉入農桿菌感受態GV3101，挑取單克隆進行菌落PCR 鑒定，選取鑒定正確的陽性菌株進行搖培，甘油保種放置于-80 ℃冰箱，以備轉化野生型擬南芥Col-0使用。

M.DNA Marker；1—3.p6MYC-GaLMI1-like表達載體。M.DNA Marker；1—3.p6MYC-GaLMI1-like expression vector.

圖4 植物表達載體p6MYC-GaLMI1-like的構建示意圖Fig.4 The construction diagram of plant expression vector p6MYC-GaLMI1-like

2.4GaLMI1-like基因功能分析

為了驗證GaLMI1-like基因在植物生長發育中的功能，利用YEP液體搖培轉化有p6MYC-GaLMI1-like重組載體的農桿菌GV3101，采用蘸花法轉化盛花期的擬南芥Col-0，收取轉基因T0種子，干燥7 d后將其播種于含有潮霉素和頭孢霉素的MS培養基上，篩選獲得T1幼苗，12 d后將其移栽于營養土中并置于光照培養箱中生長。為了驗證所篩選幼苗為陽性植株，提取21 d的擬南芥RNA并反轉錄為cDNA，半定量PCR法檢測GaLMI1-like基因在擬南芥中的表達情況，結果如圖5-A所示。在轉基因株系和野生型Col-0植株中內參基因(AtUBQ10)表達量相對一致的情況下，野生型Col-0植株中并未檢測到GaLMI1-like基因的表達條帶，而3個轉基因植株均能檢測到GaLMI1-like基因的表達條帶，說明GaLMI1-like基因已經在擬南芥中成功過表達。待生長30 d后，對3個GaLMI1-like轉基因擬南芥陽性植株進行表型觀察，發現轉基因擬南芥葉片出現多種不同的表型。如圖5-B所示，轉基因擬南芥葉片表現出單一凹陷缺刻表型和不對稱發育表型；圖5-C顯示，轉基因擬南芥顯現出弱的對稱缺刻表型；而圖5-D中轉基因擬南芥顯現出強的對稱缺刻表型。這些結果說明，GaLMI1-like在葉片發育尤其是葉片的缺刻表型形成中具有重要作用。

A.半定量鑒定GaLMI1-like轉基因擬南芥陽性植株；B—D.GaLMI1-like轉基因擬南芥陽性植株表型觀察。A.Identification of GaLMI1-like transgenic Arabidopsis by semi-quantitative PCR；B—D.The phenotypic analysis of GaLMI1-like transgenic Arabidopsis.

2.5GaLMI1-like啟動子片段的克隆

用已知的GaLMI1-like基因序列檢索棉花基因組，獲取該基因起始密碼子(ATG)上游1 439 bp的序列，設計該序列特異性引物，以亞洲棉石溪亞1號基因組DNA為模板進行PCR擴增。PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳，結果顯示，在1 500 bp左右出現一條清晰明亮的條帶，大小與預期一致(圖6)。對PCR擴增產物進行膠回收，連接到pMDTM19-T載體獲得重組質粒pMDTM19-T-pGaLMI1-like，之后進行測序和序列比對，結果顯示，擴增獲得的DNA序列與從棉花基因組檢索得到的序列完全一致，表明已經成功克隆出GaLMI1-like的啟動子序列。

M.DNA Marker；1，2.GaLMI1-like啟動子片段。M.DNA Marker；1，2.GaLMI1-like promoter fragment.

2.6GaLMI1-like啟動子順式作用元件分析

通過啟動子在線分析工具New PLACE和PlantCARE對GaLMI1-like啟動子序列所包含的順式作用元件進行分析，結果發現(表1)，該啟動子除包含基本啟動子元件CAAT-box和TATA-box[26]外，還包含光調節和光響應元件INRNTPSADB、 G-Box、GT1-motif、部分光響應模塊Box 4[27]、MYB結合位點參與光響應元件MRE、晝夜節律控制元件Circadian、細胞周期調節元件MSA-like、細胞分裂素響應元件ARR1AT以及葉肉特異表達相關原件CACTFTPPCA1、莖特異表達相關元件NODCON和根特異表達相關元件ROOTMOTIFTAPOX1。這些結果說明，該啟動子可能調控下游基因GaLMI1-like對光和晝夜節律的響應，調控其參與細胞周期和對細胞分裂素的響應，以及調控其在葉肉細胞、莖和根細胞中的特異表達。

表1 棉花GaLMI1-like啟動子順式作用元件分析Tab.1 Analysis of cis-acting elements of GaLMI1-like promoter in cotton

2.7 pCAMBIA1391-pGaLMI1-like載體的構建

經菌落PCR鑒定后，搖菌提取質粒進一步利用QuickCutTMBamH Ⅰ和QuickCutTMHind Ⅲ對pCAMBIA1391-pGaLMI1-like重組載體進行酶切鑒定，結果顯示，重組載體能夠切割出2個片段(圖7)，一條1 439 bp的條帶為pGaLMI1-like片段，另一條較大的條帶為pCAMBIA1391載體片段，與預期結果一致，說明GaLMI1-like的啟動子GUS載體pCAMBIA1391-pGaLMI1-like已被成功構建，重組載體結構如圖8所示。通過凍融法將pCAMBIA1391-pGaLMI1-like載體轉入農桿菌感受態GV3101，挑取單克隆進行菌落PCR 鑒定，選取鑒定正確的陽性菌株進行搖培，甘油保種放置于-80 ℃冰箱，以備轉化野生型擬南芥Col-0使用。

M.DNA Marker；1—3.pCAMBIA1391-pGaLMI1-like表達載體。M.DNA Marker；1—3.pCAMBIA1391-pGaLMI1-like expression vector.

圖8 植物表達載體pCAMBIA1391-pGaLMI1-like的構建示意圖Fig.8 The construction diagram of plant expression vector pCAMBIA1391-pGaLMI1-like

2.8 pCAMBIA1391-pGaLMI1-like轉基因擬南芥的鑒定

為了獲得利用GaLMI1-like啟動子驅動GUS的過表達擬南芥植株，利用蘸花法將pCAMBIA1391-pGaLMI1-like轉化盛花期的野生型擬南芥Col-0，成熟后收取T0種子。用含有潮霉素和頭孢霉素的MS培養基對T0種子進行篩選，對篩選獲得的根系較長且長出真葉的T1幼苗進行移栽培養，30 d后取T1幼苗的葉片進行DNA提取并進行PCR檢測，結果如圖9所示，轉基因陽性植株均能擴增出1 439 bp大小的條帶，而野生型對照Col-0未擴增出該目標條帶。將T1陽性植株繼續培養并收獲T1種子；利用含有潮霉素的MS培養基對T1種子繼續篩選，獲得T2幼苗并培養收獲T2種子，為后續GUS染色分析提供試驗材料。

M.DNA Marker；Col-0.野生型擬南芥(陰性對照)；1—5.轉基因擬南芥。M.DNA Marker；Col-0.Wild Arabidopsis (Negative control)；1—5.Transgenic Arabidopsis.

2.9GaLMI1-like啟動子功能分析

為了分析GaLMI1-like基因的啟動子功能，對pCAMBIA1391-pGaLMI1-like轉基因陽性擬南芥T2種子、剛萌發的種子、3 d的幼苗、12 d的幼苗、莖生葉、花和角果等器官采用GUS染色劑進行組織化學染色，結果顯示，GUS主要在子葉、真葉(蓮座葉)、莖生葉、莖和根的中柱中表達，而在花、角果和成熟種子中未見表達(圖10)。這說明GaLMI1-like基因的啟動子可驅動下游基因在子葉、真葉、莖生葉、莖和根的中柱中表達，其中主要在葉片中表達。

A.種子；B.剛萌發的種子；C.3 d的幼苗；D.12 d的幼苗；E、F.莖生葉；G.花；H.角果。A.Seed；B.Budding seed；C.Three days old seedling；D.Twelve days old seedling；E，F.Stem leaf；G.Flower；H.Silique.

3 討論與結論

在植物界，葉片的類型具有廣泛的多態性，這引起了科研人員的濃厚興趣和對其背后調控機制的廣泛研究。在分子水平上，已發現諸多基因參與葉片的生長發育[12-14，16-17]，其中LMI1及其同源基因在葉形中的功能不容忽視[17-20]。在棉花中，通過定位發現，GhLMI1-D1b主要調控陸地棉中雞腳葉的形成，而陸地棉作為四倍體植物(2n=4x=52，AADD)是由二倍體A基因組棉花(2n=2x=26，AA)和二倍體D基因組棉花(2n=2x=26，DD)進化而來的[28-29]。為解析陸地棉中來自D基因組的GhLMI1-D1b控制雞腳葉形成的原因，及陸地棉中A基因組上的GhLMI1-A能否調控雞腳葉的發育，用擬南芥LMI1序列同源比對亞洲棉基因組，將與其相似性最大的基因命名為GaLMI1-like，之后進行功能分析。GaLMI1-like蛋白結構域分析發現，其含有homeobox(HOX)結構域，這與對GhLMI1-D1b蛋白結構域的分析結果是一致的。進化分析發現，GaLMI1-like與陸地棉中登錄號為KAG4215939.1的蛋白質聚集在一起，而與D基因組棉花雷蒙德氏棉(Gossypiumraimondii)中登錄號為XP012469169.1的蛋白質并未完全聚集在一起。說明陸地棉中登錄號為KAG4215939.1的蛋白質起源于A基因組亞洲棉的GaLMI1-like，同時A基因組的GaLMI1-like與D基因組的同源蛋白(登錄號為XP012469169.1)在功能上應該具有差異性。本試驗為了研究GaLMI1-like是否具有調控葉形發育的功能，以具有雞腳葉表型的A基因組棉花亞洲棉石溪亞1號為材料，克隆了GaLMI1-like基因，并構建了GaLMI1-like基因的過表達載體p6MYC-GaLMI1-like，通過蘸花法轉化擬南芥，然后通過篩選獲得陽性植株，表型觀察發現，與對照Col-0相比，GaLMI1-like轉基因過表達擬南芥葉片具有不對稱發育表型、凹陷單一缺刻表型和對稱缺刻表型，這些結果說明，A基因組棉花中的GaLMI1-like基因可以調控棉花葉片發育及缺刻表型的產生。但是，在四倍體陸地棉中雞腳葉表型主要是由D基因組的GhLMI1-D1b調控[20]，這有可能是A基因組起源的GaLMI1-like基因被抑制了表達，其中的機制還需進一步研究。

研究發現，BnA10.LMI1上游啟動子調控區域的變異造成其表達量的上升，進而引起甘藍型油菜淺裂葉片的形成[19]。RCO(REDUCEDCOMPLEXITY)也是一個LMI1的同源基因，其增強子序列的改變引起了RCO基因表達的差異，從而調控植物產生不同的葉形[21]。在棉花中，GhLMI1-D1b啟動子中增加的一個串聯重復序列引起該基因表達量的上調，這也是形成雞腳葉表型的重要原因[20]。綜上所述，啟動子及其他調控序列所調控的基因表達差異是控制葉形的關鍵因素。因此，本研究以亞洲棉石溪亞1號為材料，克隆了棉花中LMI1同源基因GaLMI1-like的啟動子序列，通過分析發現，該啟動子序列具有多個TATA-box和CAAT-box等啟動子核心元件，說明其具有典型啟動子的特征。GaLMI1-like啟動子序列除具有典型的啟動子核心元件外，還包含許多與基因功能相關的調節元件，其中有光響應元件G-Box、GT1-motif、INRNTPSADB，晝夜節律調控元件Circadian，莖特異表達元件NODCON，根特異表達元件ROOTMOTIFTAPOX1，部分光響應模塊Box 4[27]，MYB結合位點參與光響應元件MRE。LMI1及其同源基因的主要功能是調控葉片發育形成不同葉形[17-20]，本研究也在GaLMI1-like啟動子序列中發現許多發育調節相關元件，如細胞周期調節元件MSA-like、細胞分裂素響應元件ARR1AT、葉肉特異表達元件CACTFTPPCA1，這些結果暗示，GaLMI1-like啟動子調控GaLMI1-like的時空表達進而調控棉花的葉形。進一步將GaLMI1-like啟動子連接到GUS報告基因載體pCAMBIA1391獲得重組表達載體pCAMBIA1391-pGaLMI1-like，轉化擬南芥并篩選獲得T2材料。組織化學染色結果顯示，GaLMI1-like啟動子主要驅動GUS報告基因在子葉、真葉(蓮座葉)、莖生葉、莖和根的中柱中表達，而在花、角果和成熟種子中未見表達。這些結果與對GaLMI1-like啟動子基因功能相關的調節元件分析結果是一致的。在組織化學染色結果中發現，子葉、真葉(蓮座葉)和莖生葉中GUS染色較深，其他能夠染色的部位較淺，這與之前報道LMI1及其同源基因主要控制葉形發育的研究結果[17-20]是一致的。LMI1主要在葉片的邊緣表達，尤其是在鋸齒狀部位表達量較高[17]；LMI1的同源基因RCO主要在碎米芥的2個小葉之間的凹陷處表達[21]，這與本研究發現的GaLMI1-like啟動子驅動GUS基因幾乎在整片葉子中表達不同。說明同源基因在表達模式上存在種屬差異性，所以需要對具體物種中LMI1基因的調控機制進行有針對性的研究。

綜上所述，利用PCR技術克隆了A基因組棉花亞洲棉石溪亞1號的GaLMI1-like基因及其啟動子序列，分析了GaLMI1-like蛋白的結構域和進化關系，并構建了GaLMI1-like基因的過表達載體p6MYC-GaLMI1-like，通過轉化擬南芥證實了GaLMI1-like基因具有調控葉片缺刻表型發育的功能。同時，通過在線軟件分析了該基因啟動子的順式作用元件，構建了GaLMI1-like啟動子與GUS報告基因融合的植物表達載體并轉化了模式植物擬南芥，通過GUS染色分析了GaLMI1-like基因的組織表達模式，結果顯示，GaLMI1-like啟動子可驅動下游基因在根、莖、葉中表達，且主要在葉中表達。本研究結果為進一步揭示GaLMI1-like調控棉花葉形發育的機理和利用GaLMI1-like培育理想葉型的棉花新品系奠定了基礎。