活性氧及抗病信號分子介導的向日葵抗黃萎病機制初探

張 鍵，曹 雄，楊劍鋒，賈 碩，劉 麟，阿德拉·曼德拉-俄羅摩，馮伊彤，趙 君

(1.內蒙古農業大學 園藝與植物保護學院，內蒙古 呼和浩特 010018；2.巴彥淖爾市農牧業信息中心，內蒙古 臨河 015000)

向日葵是繼大豆、油菜和花生之后的世界第四大油料作物，也是僅次于玉米的第二大雜交作物[1]。我國向日葵主要種植在東北三省、華北和西北地區，其種植面積僅次于大豆和油菜，年種植面積約為86.67萬hm2。內蒙古是我國向日葵的主產區，其種植面積和產量分別占全國的50%和52%，位居榜首[2]。然而，由于向日葵種植效益較好，向日葵播種面積不斷擴大，從而帶來了輪作倒茬的困難。向日葵的連年種植導致了向日葵病害發生嚴重。目前，向日葵黃萎病已經成為我國向日葵種植區繼菌核病之后的又一主要病害，成為制約向日葵產業發展的主要因素[3]。

引起向日葵黃萎病的病原菌是大麗輪枝菌(Verticilliumdahliae)，其屬于半知菌亞門輪枝孢屬。該病原菌寄主范圍極廣，能夠侵染包括向日葵在內的600余種植物[4]。向日葵被大麗輪枝孢菌侵染后最初癥狀表現為底層葉片中心或邊緣組織出現褪綠斑，隨后這些褪綠斑逐漸擴大并連接在一起，最終導致葉肉組織的壞死[5]。同時，病原菌能夠在維管束中借助植物的蒸騰作用向上擴展和蔓延，從而導致向日葵的上層葉片褪綠變色，最終導致植物整株枯死。生長后期發病嚴重植株的莖基部會出現縱向的黑色條斑，切開病莖后可見維管束組織變褐的現象。

在自然界中，植物總是受到各種病原物的侵襲。為了生存，植物在長期進化過程中，逐漸建立了一系列復雜的防御機制來抵御病原菌的入侵[6]。植物的防御機制通常在病原物侵染后在不同水平上發揮作用，如組織學機制、生理生化機制以及分子機制，其中組織學機制主要體現在結構抗性方面，而生理生化機制主要體現在植保素和抗菌物質的產生和積累、植物防御酶活性提高等方面，分子機制則主要表現在抗性相關基因轉錄水平提高以及抗病信號傳導等方面。

活性氧(ROS)的積累是植物受到生物和非生物的脅迫時寄主細胞內的快速反應，然而過多的活性氧也會對植物細胞造成一定的傷害[7]。超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)和過氧化氫酶(CAT)共同組成植物的ROS清除系統，植物通過這些ROS清除系統可以使細胞內活性氧的濃度處于一個相對平衡的狀態[8]，從而降低ROS對細胞的傷害，增強植物對病害的抵抗能力。此外，在植物抵御病原物入侵過程中，水楊酸(SA)、茉莉酸(JA)以及乙烯(ET)等一些信號分子發揮著非常重要的調控作用。SA一般介導活體營養型病原菌誘發植物抗性，而JA和ET介導死體營養型病原菌誘發植物抗性，上述信號分子往往通過拮抗方式調控寄主對活體和死體營養型病原菌的抗性水平[9]。

內蒙古農業大學分子植物病理實驗室前期通過抗性鑒定篩選出高抗黃萎病品種SC89和感黃萎病品種LD5009，本研究以這2個品種為材料，測定其接種黃萎病菌粗毒素后H2O2含量以及SOD、CAT、PAL、POD活性的變化，同時還在分子水平上檢測了JA路徑關鍵基因Pr5、SA路徑上游PAL合成關鍵基因Pal和ROS信號路徑的相關基因Sco、Sod及Cat等表達水平的變化，旨在為初步揭示向日葵黃萎病抗性機制提供參考依據。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

供試向日葵品種為抗黃萎病品種SC89和感黃萎病品種LD5009。

供試菌株為黃萎病菌株V89采集自內蒙古五原縣，經單孢分離和分子鑒定確定是大麗輪枝菌。

供試培養基為馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基(PDA)：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂粉15 g、水1 000 mL；查氏培養基(Cazpek)：NaNO32 g、K2HPO41 g、KCl 0.5 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、FeSO40.01 g、蔗糖30 g、水1 000 mL。

試劑及其配方為100 μmol/L H2O2：取30%分析純H2O257 μL，溶于100 mL丙酮，再稀釋100倍；5%(m/V)硫酸鈦：5 g硫酸鈦，溶于100 mL 2 mol/L硫酸。

1.2 試驗方法

1.2.1 接種處理 參照任杰等[10]有關向日葵黃萎病的接種方法，利用20 mL 黃萎病菌粗毒素提取液(濃度為200 μg/mL)對向日葵幼苗進行處理。將處理后的向日葵苗置于25 ℃條件下光照培養箱中培養，分別于接種后0，6，12，24，36，48，72 h進行取樣(取樣部位為第2，3片真葉)，按照每份樣品0.1 g進行稱量，液氮速凍后置于-80 ℃冰箱保存備用。每個品種處理10株，共設置3次重復，并設清水處理作為對照。

1.2.2 H2O2和酶液的提取與測定 H2O2提取與定量參照卜浩宇[11]的方法進行。SOD、CAT、PAL液提取及測定參照李合生[12]的方法進行，POD液提取及測定參照郝再彬[13]的愈創木酚法。每個試驗3次重復。

1.2.3 植物總RNA的提取 按照BioFlux公司的RNA提取試劑盒(RNAiso Reagent)的說明書提取毒素處理0，6，12，24，36，48，72 h后的向日葵葉片RNA。并采用博日科技公司BioRT cNDA第一鏈合成試劑盒將提取的RNA合成cDNA。

1.2.4 抗性相關基因轉錄水平的測定 采用RT-PCR技術對Pal、Pr5、Sod、Sco和Cat等6個抗性相關基因的轉錄水平進行測定，基因的引物信息見表1。RT-PCR反應體系為25 μL，包括引物F/R各1.0 μL、10×TaqBuffer 2.5 μL、10 mmol/L到dNTP 0.5 μL、TaqDNA Polymerase 0.5 μL、cDNA 1.0 μL、ddH2O 18.5 μL。RT-PCR反應條件為：94 ℃預變性3 min；94 ℃變性1 min，退火溫度(參照表1引物各自退火溫度)1 min，72 ℃延伸2 min，32個循環；最后72 ℃ 延伸10 min。PCR產物用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，電壓90 V，持續30 min。利用Image Pro軟件對結果進行量化比較，計算各基因的相對表達量。

表1 PCR所用引物Tab.1 Sequences of the primers used in PCR

1.3 數據統計與分析

試驗數據采用SPSS 18.0軟件進行統計分析，應用Duncan氏新復極差法進行差異顯著性檢驗(P<0.05)。

2 結果與分析

2.1 抗、感向日葵品種接種后H2O2含量變化

由圖1可知，抗病品種SC89在接種毒素后12，36 h出現2個峰值，分別為0.55,0.60 μmol/g，變化趨勢總體為先增加后降低，感病品種LD5009在接種種毒素后12 h出現峰值，達到0.17 μmol/g，隨后降低。雖然，在感病品種LD5009中H2O2的含量在接種后也出現了過量表達的峰值，但是在各個接種時間點H2O2的含量始終低于抗病品種SC89。由此可見，利用大麗輪枝菌的毒素進行接種處理能夠誘導向日葵葉片中H2O2的積累，且抗病品種中積累的速度和積累的量均快于和高于感病品種。

不同小寫字母表示在P<0.05水平差異顯著。Different lowercase letters indicate significant difference at P<0.05 level .

2.2 抗、感向日葵品種接種后植物防御酶活性的變化

由表2可知，接種前(0 h)，抗、感品種SOD活性沒有顯著差異。接種后，抗、感品種向日葵葉片中SOD活性均呈現先升高后逐漸降低的趨勢，但是抗病品種中出現2個峰值，而感病品種僅出現一個峰值，且峰值出現時間滯后于抗病品種。相比感病品種，抗病品種在接種后SOD活性增加更顯著，如接種12 h后，抗病品種SC89的SOD活性達到高峰56.96 U/(g·min)，隨后降低到接種24 h的47.91 U/(g·min)，接著在接種48 h后又達到另一個高峰60.93 U/(g·min)，相比接種前(0 h)SOD活性28.39 U/(g·min)升高了32.13 U/(g·min)，增加113.17%；而感病品種LD5009在接種36 h后才達到高峰49.13 U/(g·min)，隨后開始下降，相比接種前(0 h) 28.80 U/(g·min)，接種36 h后SOD活性增加了20.33 U/(g·min)，增加比例為70.59%。

由表2可知，在接種前(0 h)，SC89中的CAT活性略高于LD5009；但在接種后其他時間點，SC89葉片的CAT活性一直高于LD5009。接種后，SC89的CAT活性均呈現上升趨勢，并在接種24 h出現一個峰值，但是在隨后的時間點，CAT活性略有下降后一直維持一個較高水平；而LD5009在接種24 h和48 h后酶活性達到2個小的峰值，隨后降低到接種起始點水平。SC89在接種24 h后，CAT活性達到峰值0.11 U/(g·min)，相比接種起始點，酶活性增加83.33%；而LD5009同樣在接種24 h后，達到最高峰0.07 U/(g·min)，酶活性增加75%。

由表2可知，接種前(0 h)，抗病品種葉片的 POD 活性高于感病品種。接種后，抗病品種的 POD 活性呈現上升—下降—略上升—下降—略上升的趨勢，并在接種12 h出現一個高峰值，隨后在36，72 h又出現2個小峰值；而感病品種在12 h達到一個峰值，隨后在36 h出現一個小峰值。相比不同時間點酶活性水平，SC89接種后水平一直顯著高于LD5009(P<0.05)。接種12 h后SC89 POD活性達到峰值3.46 U/(g·min)，相比接種前(0 h)升高1.86 U/(g·min)，酶活性增加116.25%；而接種后相同時間點，LD5009 中POD活性為1.78 U/(g·min)，相比接種前升高0.53 U/(g·min)，酶活性增加42.4%；在接種24 h后，SC89中 POD活性略有下降并保持較高活性；LD5009的 POD 活性與SC89的變化趨勢一致，但活性較低。

由表2可知，接種前(0 h)，抗感病品種中PAL活性基本一致。接種后，抗、感品種PAL的活性均呈現先升后降的趨勢，且抗病品種升高的幅度略高于感病品種；在接種24 h后，抗、感品種中的PAL活性同時達到最高峰17.87，13.80 U/(g·min)，相比接種前，SC89中PAL活性升高 10.14 U/(g·min)，增加131.18%，而LD5009中PAL活性僅升高了6.36 U/(g·min)，增加85.48%。

表2 抗、感向日葵品種接種毒素后植物防御酶活性變化Tab.2 Changes of defense enzyme activity in sunflower varieties with V.dahliae toxin U/(g·min)

2.3 抗性相關基因轉錄水平變化

由圖2可知，抗病品種中JA路徑中關鍵基因Pr5本底水平高于感病品種；并且接種后，抗病品種中Pr5基因誘導表達迅速，并在接種后36 h達到最高值，隨后在接種后72 h降低至本底水平(圖2-A)。而感病品種接種后雖然Pr5也能夠被誘導，但誘導的程度明顯低于抗病品種。Pal基因作為SA合成路徑中的關鍵基因，在接種處理后能迅速被上調，但是在抗病品種中誘導的水平明顯高于感病品種(圖2-B)。Sod、Sco和Cat基因是H2O2代謝途徑中的關鍵基因，接種后，盡管抗病品種SC89中Sod的本底水平顯著高于感病品種LD5009(P<0.05)，但是接種后，抗病品種Sod基因轉錄水平在接種后48 h出現一個明顯的峰值，而感病品種在同一時間點卻沒有升高的趨勢(圖2-C)。Sco基因接種后在抗、感品種均可以被誘導，但是抗病品種誘導的水平略高于感病品種，且高水平表達的時間也比感病品種要長(圖2-D)。Cat基因編碼過氧化氫酶(CAT)，能夠將H2O2降解成為H2O及O2。接種處理后，抗、感品種中Cat基因的表達均被誘導，且在接種36 h后達到最高點，抗性品種中該基因誘導的水平顯著高于感病品種(圖2-E)。上述結果預示，H2O2、JA和SA信號路徑參與向日葵對黃萎病抗性的建立過程。

A.Pr5基因相對表達量；B.Pal基因相對表達量；C.Sod基因相對表達量；D.Sco基因相對表達量；E.Cat基因相對表達量。A.Relative expression of Pr5 gene；B.Relative expression of Pal gene；C.Relative expression of Sod gene；D.Relative expression of Sco gene；E.Relative expression of Cat gene.

3 結論與討論

植物的防衛反應是復雜的細胞生理活動的結果，其生理反應是通過一系列的酶催化過程來實現的。自Fridovich[14]提出生物超氧離子自由基學說以來，細胞防御酶系統與植物抗病性的關系引起了人們的普遍關注。宋培玲等[15]將油菜黑脛病菌接種至不同抗性水平的油菜中發現，抗感品種中POD、PPO、CAT、PAL和SOD等5種防御酶活性顯著升高，且抗病品種中防御酶活性遠遠高于感病品種。汪紅等[16]研究發現，不同抗性品種的棉花在接種黃萎病菌后，POD、PPO、PAL等防御酶活性被誘導升高，且抗病品種反應速度和強度都要高于感病品種。本實驗室前期通過對向日葵不同品種接種黃萎病菌毒素，發現在接種72 h感病品種已經呈現非常明顯的發病癥狀。因此，推測防御酶系的變化應該在出現癥狀之前發生。本研究中，抗、感向日葵黃萎病品種中的4種防御酶活性在本底水平(0 h)并無太大差異，但在接種之后其活性卻表現出很大差異，說明病原菌毒素處理后會誘導植物體內防御酶活性的升高。本試驗中，抗病品種SC89在接種12 h后，SOD活性達到第一個高峰，同時POD活性也升至最高，且抗病品種中這2種酶活性均明顯高于感病品種。SOD、POD通過酶促反應能將植物體內超氧陰離子等氧自由基轉變為H2O2，H2O2能夠誘發植物細胞的程序性死亡。CAT是植物體內重要的活性氧清除酶類，能夠維持體內的活性氧代謝平衡，保護膜結構，從而使植物能在一定程度上忍耐、減緩或抵抗逆境脅迫[17]。本研究中，接種病原菌毒素之后，抗、感向日葵品種中的CAT活性均呈先上升后逐步降低的趨勢。抗病品種在接種24 h后，CAT活性達到高峰，在時間點上略晚于SOD及POD活性變化速度，這可能是由于超氧陰離子等氧自由基等首先需要通過SOD、POD等酶轉化成H2O2，之后才能夠通過CAT等活性氧清除酶類將H2O2降解成為H2O及O2的原因。

PAL是催化苯丙烷類代謝第一步反應的酶，也是聯系初級代謝和次級代謝的限速酶和關鍵酶[18]，苯丙烷類代謝的中間產物酚類物質和終產物黃酮、異類黃酮、木質素等物質參與植物的抗病原菌侵入過程，從而防御病原生物的侵染[19-20]。本研究中，抗、感向日葵品種接種后，PAL的活性均呈現先升高后降低的趨勢，并且抗病品種PAL的活性明顯高于感病品種。這一結果與馬鈴薯感染晚疫病、小麥感染白粉病和稈銹病后，PAL活性變化結果相一致[21-22]。

在植物的抗病反應建立過程中，植物內源信號分子如SA、JA以及ET等信號分子發揮著非常重要的信號轉導作用。JA一方面能夠通過誘導植物次生代謝物質的積累提高植物的抗性，另一方面JA還能激活許多抗逆基因如PDF1.2和Thi2.1[23-24]。本試驗中，檢測了一些抗黃萎病相關的基因的表達，特別是接種前后SA和JA信號路徑中關鍵基因轉錄水平的變化。如JA路徑的關鍵基因Pr5，在毒素處理后，抗、感品種均有誘導表達，且在抗病品種中誘導表達的水平顯著高于感病品種，表明JA路徑參與了向日葵抗性建立過程。SA作為植物產生局部抗病反應與系統獲得抗性反應(Systemic acquired resistance，SAR)的重要信號分子在植物抗性建立過程中發揮著重要的作用[25]。本研究中，Pal作為SA合成路徑中的關鍵元件，在接種后抗感品種中該基因均能被誘導上調表達，且抗病品種中Pal基因的上調更為顯著，表明SA的合成路徑參與了向日葵抗性建立。

H2O2作為信號分子參與植物體內各種代謝過程，同時也是寄主植物受到病原物侵染后植物抗性建立的顯著標志。研究表明，在病原菌侵染早期，寄主植物的侵染點部位會產生大量的活性氧即“氧爆發”，形成大量的氧自由基和H2O2。本研究通過檢測接種前后抗、感品種中H2O2含量以及H2O2形成有關的基因如Sod、Sco以及Cat轉錄水平的變化，發現抗病品種中H2O2形成能夠顯著被病原菌所誘導，且誘導的水平明顯高于感病品種。這一結果表明，在向日葵與黃萎病菌互作的過程中，H2O2的積累和向日葵抗性建立密切相關。同時，抗病品種中ROS清除酶如超氧化物歧化酶(SOD)和過氧化物酶(POD)等酶活性的變化與H2O2的積累具有高度一致性。因此認為，在向日葵抗性建立過程中活性氧作為一個非常重要的信號分子發揮著重要的作用。

本研究結果表明，POD、SOD、CAT及PAL等4種防御酶活性變化與向日葵的品種抗性有關，且接種黃萎病菌毒素后，SA、JA以及H2O2等信號分子在向日葵抗性建立過程中均發揮著重要的作用，特別是SA和JA信號路徑在向日葵抗性建立過程中呈現協同作用。然而，SA和JA是如何協同作用增強向日葵抗性，SA 和JA信號路徑和H2O2信號分子是如何應答等問題還需在未來的研究中進行進一步探究。