真核基因組編碼大量長鏈非編碼RNA癌易感性候選基因15在肺癌細胞中表達上調且通過miR-153-3p激活Wnt/β-catenin通路調控A549細胞增殖、侵襲及化療敏感性實驗研究

賀 軻,李 凱

(1.廣東省第二人民醫院普外一科，廣東 廣州510317；2.西安市第三醫院心血管外科，陜西 西安710032)

肺癌包括小細胞肺癌和非小細胞肺癌，是全球最常見的癌癥相關死亡原因，5年生存率約為16.6%[1-2]。然而，多種已知致癌物的存在以及不同的遺傳背景，使得肺癌的發生發展中致癌因素變得難以確定。因此，研究其潛在的致病機制和更準確的預測生物標志物是十分必要的。真核基因組編碼大量長鏈非編碼RNA(Long non-coding RNA,lncRNA)是指長度超過200個核苷酸的內源性細胞RNA，但缺乏顯著長度的開放閱讀框[3]。雖然大多數lncRNA的功能尚不清楚，但其數量的增加以及參與許多生物學過程的證據的積累，為lncRNA的失調與惡性細胞中的癌癥發展、侵襲和轉移提供了令人信服的論據[4-5]。例如lncRNA PVT1通過激活KAT2A乙酰轉移酶和穩定HIF-1α調控鼻咽癌細胞增殖[6]。Chen等[7]發現CCAT2預測小細胞肺癌的不良預后并調節生長和轉移。還發現TCF-4調控的lncRNA-XIST促進巨噬細胞M2極化，與肺癌相關[8]。lncRNA 癌易感性候選基因15(Cancer susceptibility candidate 15，CASC15)是一種新發現的致癌基因，例如早期發現的口腔鱗癌患者血漿lncRNA CACS15上調[9]。lncRNA CACS15通過海綿miR-145正向調控ABCC1參與結直腸癌奧沙利鉑耐藥[10]。有文獻報道lncRNA CASC15通過靶向miR-200a-3p促進前列腺癌的遷移和侵襲[11]。這些結果表明，lncRNA CASC15在惡性腫瘤的發生發展進程中起著重要作用。然而，lncRNA CASC15與肺癌進展之間的相互作用尚不明了。因此，lncRNA CASC15在肺癌中的作用及其機制仍有待確定。我們在本實驗中主要通過探討lncRNA CASC15對肺癌A549細胞增殖、侵襲和化療敏感性的影響，進一步深入了解肺癌的發病機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 65例肺癌組織與50例癌旁組織納入本研究，手術中切除了肺癌組織，并在-80 ℃的液氮中保存。所有的參與者都同意實驗方案和計劃，該項目經過了本醫院倫理委員會批準。肺癌A549細胞和正常肺上皮BEAS-2B細胞有中國科學院上海細胞庫提供。DMEM培養基、由美國Gibco公司提供。FBS來自美國Clarkbio公司。ECL蛋白發光試劑盒來自美國Pierce公司。RIPA裂解液購自上海碧云天生物科技有限公司。miR-153-3p抑制劑(miR-153-3p inhibitor)、miR-153-3p模擬物(miR-153-3p mimics)來自Genepharma公司。CASC15 siRNA、pcDNA-CASC15質粒來自上海生工有限公司。凋亡檢測試劑盒來自美國BD公司。順式-二氯二氨合鉑(批號:9712055)。

1.2 實驗方法

1.2.1 A549和BEAS-2B細胞培養： 參與本研究的肺癌A549細胞和正常肺上皮BEAS-2B細胞置于DMEM 中添加10%胎牛血清培養。培養的細胞在常規條件下(37 ℃、5% CO2和飽和濕度)條件下生長。

1.2.2 細胞轉染：生物公司根據基因的目標序列設計合成重組質粒后，將轉染組分為：①siRNA NC、CASC15 siRNA組；②Control、XAV939組；③inhibitor NC、miR-153-3p inhibitor、miR-153-3p inhibitor+XAV939組；④pcDNA-3.1(+)+mimics NC、pcDNA-CASC15+mimics NC、pcDNA-3.1(+)+miR-153-3p mimics、pcDNA-CASC15+miR-153-3p mimics組。按照Lipofectamine 2000的方法質粒共轉染A549細胞，12 h更換新鮮培養基。采用RT-qPCR檢測轉染效率。

1.2.3 細胞增殖能力測定：轉染后第2天后進行細胞增殖試驗，另外96孔板中的轉染完成的A549細胞在培養箱中孵育12 h后用不同濃度順鉑(0、2、4、8、16 μg/ml)處理細胞，48 h后加入10 μl/孔CCK-8試劑，在培養箱中繼續孵育4 h。用酶標儀在450 nm處測定吸光度OD值。試驗重復了3次，然后記錄并分析數據，制作細胞增殖圖。

1.2.4 雙熒光素酶報告基因活性檢測：基于lncRNA CASC15的全序列，利用miRcode生物信息學網站分析預測可能針對CASC15的miRNAs。CASC15野生型(WT)的非翻譯區、包含miR-153-3p的潛在結合位點以及CASC15突變的相應3’非翻譯區被克隆到psiCheck2雙熒光素酶報告基因中。A459細胞用含有3’非翻譯區報告基因瞬時轉染，并使用雙熒光素酶報告基因檢測系統在熒光素酶活性后48 h報告miR-153-3p模擬物和陰性對照的轉錄。雙熒光素酶檢測進行以確認miR-153-3p和CASC15的靶標關系。

1.2.5 細胞侵襲實驗： Transwell法檢測細胞侵襲情況。簡單的步驟如下：轉染24 h后，將細胞消化重懸于無胎牛血清和雙抗體的培養基中。稀釋Matrigel 基質后將200 μl加入Transwell上室，12 h后在上層加入細胞懸液200 μl，24孔板下層加入含血清培養基500 μl。繼續培養24 h后，取出小室，棄去培養基，每個室加500 μl PBS洗2次，室溫甲醇固定60 min。然后擦拭濾片表面的細胞，用結晶紫染色30 min。然后在顯微鏡下觀察細胞并拍照。

1.2.6 流式細胞儀檢測細胞凋亡率： A549細胞轉染成功后用16 μg/ml順鉑處理細胞，第2天后用0.25%胰酶消化并收集細胞，用流式緩沖液重懸細胞，每孔細胞和5 μl Annexin V-APC孵育30 min，再與5 μl PI一起孵育5 min,最后檢測細胞凋亡率。

1.2.7 實時定量PCR (RT-qPCR)： RNA提取和定量實時聚合酶鏈反應試驗按步驟進行。用Trizol從細胞和組織中提取總RNA，測定濃度后用引物逆轉錄試劑盒合成cDNA。用SYBR Green染料進行定量實時聚合酶鏈反應分析。甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)用作基因表達的標準化對照。結果通過2-△△Ct法分析。所用的引物見表1。

表1 引物序列

1.2.8 Western blot： 用RIPA裂解緩沖液從細胞和組織中提取蛋白質，并用BCA試劑盒進行定量。將蛋白質樣品進行10%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳，并轉移到聚偏氟乙烯膜上。β-catenin、CyclinD1和 c-myc蛋白抗體用于孵育膜。第2天，膜與二級抗體一起孵育，最后取PVDF膜進行蛋白顯影。

1.3 統計學方法 采用SPSS 18.0統計學軟件進行分析，繪圖軟件采用Graphpad Prism 5。統計值以均數±標準差表示。組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 RT-qPCR檢測CASC15表達及沉默CASC15影響A549細胞增殖、侵襲及化療敏感性 由RT-qPCR結果可知，肺癌組織、癌旁正常組織、A549和BEAS-2B細胞中CASC15基因表達分別為(2.56±1.04)、(1.02±0.34)、(1.98±1.02)、(0.96±0.05)，結果說明CASC15在肺癌組織和A549細胞中表達上調(P<0.01)。CASC15 siRNA組A549細胞內CASC15基因表達(0.32±0.78)顯著低于siRNA NC組(1.14±0.54，P<0.01)。分析圖1結果可知，和siRNA NC組相比，CASC15 siRNA轉染A549細胞48 h后增殖活力顯著降低(P<0.01)，CASC15 siRNA轉染組A549細胞侵襲數目明顯減少(P<0.01)。而用不同濃度順鉑(0、2、4、8、16 μg/ml)作用細胞后，下調CASC15明顯降低細胞增殖活力，使細胞凋亡率明顯上升(P<0.01)。

A：沉默lncRNA CASC15表達后利用CCK-8法測定A549細胞增殖活力；B：沉默lncRNA CASC15表達后利用Transwell測定A549細胞侵襲數目；C:A549細胞侵襲數目；D：不同濃度順鉑處理細胞，利用CCK-8法分析沉默CASC15表達后A549細胞增殖活力；E:16 μg/ml順鉑處理細胞并沉默CASC15表達，流式細胞儀檢測A549細胞凋亡率的;F:A549細胞凋亡率。組間比較，*P<0.05

2.2 lncRNA CASC15靶向miR-153-3p 圖2A為miRcode預測的CASC15和miR-153-3p之間的結合位點。由圖2B結果可知，和mimics NC+CASC15 wt組相比，CASC15 wt+miR-153-3p mimics組細胞的熒光素酶活性顯著降低(P<0.01)，和mimics NC+CASC15 mut組相比，CASC15 mut+miR-153-3p mimics組細胞的熒光素酶活性無明顯變化(P>0.05)。

A:軟件預測lncRNA CASC15與miR-153-3p之間的靶向結合點;B:雙熒光素酶報告基因檢測lncRNA CASC15與miR-153-3p之間的相關性，*P<0.05

2.3 RT-qPCR檢測miR-153-3p表達及沉默miR-153-3p影響A549細胞增殖、侵襲及化療敏感性 由RT-qPCR結果可知，肺癌組織、癌旁正常組織、A549和BEAS-2B細胞中miR-153-3p基因表達分別為(0.65±0.98)、(1.24±0.52)、(0.76±1.16)、(1.76±0.42)，結果說明miR-153-3p在肺癌組織和A549細胞中表達下調(P<0.01)。miR-153-3p inhibitor組A549細胞內miR-153-3p基因表達(0.39±0.72)顯著低于siRNA NC組(1.07±0.62,P<0.01)。分析圖3結果可知，和inhibitor NC組相比，miR-153-3p inhibitor轉染A549細胞48 h后增殖活力顯著上調(P<0.01)，miR-153-3p inhibitor轉染組A549細胞侵襲數目明顯增加(P<0.01)。而用不同濃度順鉑(0、2、4、8和16 μg/ml)作用細胞后，下調miR-153-3p 明顯升高了細胞增殖活力，使細胞凋亡率明顯降低(P<0.01)。

2.4 lncRNA CASC15通過miR-153-3p影響A549細胞增殖、侵襲及化療敏感性 由圖4A-C 結果可知，與pcDNA-3.1(+)+mimics NC組對比，pcDNA-CASC15+mimics NC組A549細胞活力和侵襲數目顯著上調(P<0.01)，pcDNA-3.1(+)+miR-153-3p mimics組細胞活力和侵襲數目明顯降低(P<0.01)，pcDNA-CASC15+miR-153-3p mimics組細胞活力和侵襲數目明顯高于pcDNA-3.1(+)+miR-153-3p mimics組(均P<0.01)。由圖4D-F結果可知，16 μg/ml順鉑作用細胞后，與pcDNA-3.1(+)+mimics NC組對比，pcDNA-CASC15+mimics NC組A549細胞活力顯著上調(P<0.01)，細胞凋亡率顯著降低(P<0.01)。pcDNA-3.1(+)+miR-153-3p mimics組細胞活力明顯降低(P<0.01)，細胞凋亡率顯著上升(P<0.01)。和pcDNA-3.1(+)+miR-153-3p mimics組相比，pcDNA-CASC15+miR-153-3p mimics組A549細胞活力顯著上調(P<0.05)，細胞凋亡率顯著降低(P<0.01)。

2.5 過表達及沉默miR-153-3p對A649細胞Wnt/β-catenin信號通路的影響 由圖5A-B 結果可知，和inhibitor NC組相比，miR-153-3p inhibitor轉染A549細胞后胞內β-catenin/GAPDH、CyclinD1/GAPDH和c-myc/GAPDH比值升高(P<0.01);和mimics NC組相比，miR-153-3p mimics組細胞內β-catenin/GAPDH、CyclinD1/GAPDH和c-myc/GAPDH比值降低(P<0.01)。表明沉默miR-153-3p激活了A649細胞Wnt/β-catenin信號通路。

A：Western blot檢測過表達及沉默miR-153-3p對A549細胞內CyclinD1、β-catenin、c-myc表達的影響；B：相對蛋白表達水平，組間比較，*P<0.05

2.6 miR-153-3p通過Wnt/β-catenin信號通路影響A549細胞增殖、侵襲及化療敏感性 分析圖6結果可知，和inhibitor NC組相比，miR-153-3p inhibitor轉染A549細胞48 h后增殖活力顯著上調(P<0.01)，細胞侵襲數目明顯增加(P<0.01)。16 μg/ml順鉑作用細胞后，miR-153-3p inhibitor明顯升高了細胞增殖活力(P<0.05)，降低了細胞凋亡率(P<0.01)。和miR-153-3p inhibitor組相比，miR-153-3p inhibitor+XAV939組細胞增殖活力顯著降低(P<0.01)，細胞侵襲數目明顯減少(P<0.01)，16 μg/ml順鉑作用細胞后，miR-153-3p inhibitor+XAV939明顯降低了細胞增殖活力(P<0.05)，提高了細胞凋亡率(P<0.01)。

A：miR-153-3p通過Wnt/β-catenin信號通路對A549細胞增殖活力的影響；B：miR-153-3p通過Wnt/β-catenin信號通路對A549細胞侵襲的影響；C:A549細胞侵襲數目；D：16 μg/ml順鉑處理細胞后miR-153-3p通過Wnt/β-catenin信號通路對A549細胞增殖活力的影響；E:16 μg/ml順鉑處理細胞后miR-153-3p通過Wnt/β-catenin信號通路對A549細胞凋亡率的影響;F:A549細胞凋亡率。組間比較，*P<0.05

3 討 論

新出現的證據證明，失調的lncRNAs在調節生物過程中具有重要作用，如細胞增殖、侵襲和凋亡等生物學進程。對于肺癌的腫瘤發生機制，已有大量關于其增殖、侵襲、轉移的分子研究[12]。如Jiang等[13]研究發現lncRNA HOTAIR通過上調miR-613影響非小細胞肺癌的發生和轉移。有研究表明lncRNA-MALAT1通過STAT3激活上調MRP1和MDR1，參與肺癌順鉑耐藥[14]。綜合所述，lncRNA可能在肺癌的腫瘤進展過程中發揮重要調控作用。CASC15作為一個非常重要的lncRNA，在人類疾病中，如賁門舌鱗癌進展、肥大和肝細胞癌，已被確定為致癌RNA[15]，在本研究中，我們發現lncRNA CASC15在肺癌細胞和組織中顯著增加，我們的結果與之前的研究結果一致，表明CASC15在癌細胞中均處于表達上調趨勢。分析CASC15在癌細胞中的差異表達與其發揮的生物學功能，我們猜想CASC15也可能在A549細胞發展中發揮促癌作用。

僅探明lncRNA CASC15在肺癌惡性行為中的作用是不夠的，因此，我們進一步研究了CASC15調控肺癌腫瘤發生的深層次機制。lncRNA最重要的分子機制之一是其作為ceRNA海綿化miRNA的作用。我們發現通過生物信息學在線工具預測lncRNA CASC15的下游靶點miR-153-3p，然后通過熒光素酶報告基因檢測進行了確認，很明顯lncRNA CASC15可以作為miR-153-3p海綿，這一結果為我們的猜想提供了有力的支持。RT-qPCR結果表明miR-153-3p在肺癌細胞和組織中表達是下調的。有文獻報道miR-153-3p在乳腺癌細胞中表達下調，靶向下調Rho相關螺旋卷曲蛋白激酶1(Rho-associated coiled coil-forming protein kinase 1,ROCK1)基因抑制乳腺癌細胞增殖及遷移。miR-153-3p通過靶向MCL1基因調控卵巢癌的體內外進展[16]。miR-153-3p通過抑制E3F3表達抑制甲狀腺癌細胞增殖、侵襲和糖酵解[17]。另外還發現miR-153-3p在復發OS組織、MG63/DDP、U2OS/DDP細胞中明顯降低。我們參照miR-153-3p在其他癌癥中發揮的功能，猜想miR-153-3p可能在肺癌中也是具有抑癌作用。在接下來的生物學功能驗證中發現了沉默miR-153-3p促進了肺癌A549細胞的增殖和侵襲，下調了A549細胞對順鉑的化療敏感性。且lncRNA CASC15靶向miR-153-3p對A549細胞發展及其化療敏感性具有調控作用。因此，我們發現了lncRNA CASC15/miR-153-3p反饋回路在肺癌發展中的重要作用。Wnt/β-連環蛋白信號通路是控制胚胎發育的重要途徑。β-連環蛋白向細胞核的轉移誘導大量轉錄因子的激活，進一步調節下游信號級聯。先前的研究已經確定了Wnt/β-連環蛋白信號通路參與了如前列腺癌、肺癌、結直腸癌和乳腺癌等各組癌癥的發展及其他生物學進程[18-20]。我們發現miR-153-3p的下調顯著激活了Wnt/β-連環蛋白信號通路，抑制通路后，miR-153-3p對肺癌細胞發展的調控作用也明顯下調。在本研究中我們發現了一個新的調控通路lncRNA CASC15/miR-153-3p/Wnt/β-catenin對于A549細胞的增殖、侵襲和化療敏感性至關重要，然而該通路是否在其他肺癌細胞系中發揮同樣的生物學作用尚不清楚，此外在其他肺癌細胞中，lncRNA CASC15是否是靶向其他miRNA發揮促癌作用也不明了，這也是文章的不足之處，需要進一步深入研究和探討。

在本研究中，我們發現了lncRNA CASC15在肺癌腫瘤發生過程中的重要調控作用，通過靶向miR-153-3p激活Wnt/β-catenin通路參與了肺癌細胞的惡性行為，研究結果揭示了調控肺癌發展的新通路，值得深入研究。