小鼠原位肺癌模型構建及在放射治療研究中的意義

劉振宇,王宏偉

(內蒙古醫科大學附屬醫院放射治療科,內蒙古 呼和浩特 010050)

WHO、Globcan 2020統計報道2020年肺癌新發病例2206771例，占比約11.4%，是2020年癌癥病發率的第二位，而肺癌死亡病例為1796144例，占比約18%，病死率排第一位。盡管手術、放療、化療和靶向治療取得了很大進展，但由于在診斷時大多數患者已局部晚期或出現轉移，預后仍然較差，5年生存率僅為15%[1]。醫學動物實驗是基礎實驗研究的重要組成部分，更是臨床實驗及治療的理論依據和基礎。理想的動物模型應該具備動物來源容易、操作簡單、定位準確、重復性好、腫瘤組織學類型、生物學特征與人類相近、所需周期較短、移植成功率高等特點。C57BL/6小鼠除了具備上述特點，還有價格低廉、耐受性強、模型成熟、免疫功能正常的優勢[2]。小鼠肺臟在生物特性、分子特征方面和人類具有相似性，幾乎能找到所有人類同源基因[3]。周足力等[4]用免疫缺陷裸鼠荷人源肺惡性腫瘤的建模成功率是29.65%，腫瘤生長達500 mm3所用平均成瘤時間約32～237 d，該模型雖在臨床藥物實驗及還原人類肺癌基因型發揮了一定作用，但成瘤時間長且成瘤率較低，仍需加以改進以提高臨床實用性。為驗證原位小鼠肺癌模型的可行性和穩定性，以及在活體實驗動物的情況下直觀觀察腫瘤生長特性及侵襲性，本實驗以LLC小鼠肺癌細胞系直接經皮穿刺原位接種于10只C57BL/6小鼠肺內，并以肺部磁共振成像(MRI)的方法直觀檢驗。原位移植模型腫瘤侵襲特征及組織病理學、生物學特性,是一種接近肺癌患者的模型,為肺癌放射治療等研究提供良好的實驗平臺。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 試劑與器材：小鼠肺癌細胞系(LLC細胞系)。用“四季青”新生牛血清(批號：19120103)，GE公司DMEM/HIGHGLUCOSE基礎培養基(批號：AF29498406),配置含10%血清DMEM/HIGHGLUCOSE基礎培養基加1%雙抗(100 U/ml青霉素,100 μg/ml鏈霉素)。置于37 ℃、5%CO2混合氣體培養箱。水合氯醛溶液、磷酸鹽平衡生理鹽水溶液(PBS平衡鹽液)、0.25%胰酶(GE公司)、培養箱、超凈臺、熒光顯微鏡等均由內蒙古農業大學生物科學萬方教授團隊腫瘤實驗室提供。磁共振成像設備及技術支持由內蒙古醫科大學第一附屬醫院影像科提供。

1.1.2 實驗動物:無特定病原體(SPF)級C57BL/6小鼠，6～8周，雌性，體重約22 g，共10只，實驗動物由內蒙古農業大學動物實驗室提供，飼養于內蒙古農業大學生命科學院動物實驗室SPF級飼養間并進行無菌手術操作。本實驗經由內蒙古醫科大學科研中心動物實驗室批準，并按實驗動物使用的3R原則給予人道主義關懷。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養：LLC細胞系經由公司發貨干冰運輸隔天到，密封完好，給予-80 ℃冰箱保存；隔日復蘇，置于含10%血清、1%雙抗的DMEM/HIGHGLUCOSE基礎培養基中，放于37 ℃、5%CO2培養箱中培養。每天鏡下觀察細胞生長狀態，每2天換液處理，約每3 d進行消化傳代一次。細胞匯合率達80%傳代培養(圖1)。

1.2.2 動物模型的建立：細胞計數板計數及配制2×107個/ml，LLC細胞無血清懸液0.2 ml，在SPF級手術間操作，腹腔注射濃度為4%的水合氯醛溶液麻醉(麻醉用量為小鼠體重的1%)，小鼠右側臥位，定位于小鼠左側腋下以碘伏消毒并備皮，再次消毒后行1 cm切口，鈍性分離至肋骨表面，可見明顯呼吸及肺臟活動，在肋骨上緣1 ml注射器垂直穿刺約3 mm，緩慢注射細胞懸液約50 μl并停留3～5 s迅速拔針，觀察數秒是否氣胸形成，呼吸如常，碘伏再次消毒以細絲線單純間斷縫合2針。將手術后小鼠放置鼠籠，觀察至心肺活動及進食水正常。

2 結 果

2.1 細胞生長情況 體外培養LLC細胞系鏡下呈現出梭形，并通過細胞計數板計數發現體外細胞第3天出現快速增長，并且在25 cm2卡瓶中匯合率達80%，可進行1∶2傳代培養(圖1)。

2.2 動物MRI影像學表現 實驗小鼠自移植腫瘤后每7天行MRI掃描，每次MRI參數一致并使用同一線圈。圖2為移植第21天后影像學圖像示左側肺內多個邊界尚清、混雜信號的不規則腫塊影、多層面顯示氣管及血管受侵征象、縱膈淋巴結融合影，對側肺臟可見有明顯數量不等轉移灶，影像信號似人類肺腫瘤顯示，未發現肝臟腎臟異常信號影。解剖后證實位置及大小同影像學表現。

圖2 移植第21天實驗鼠MRI成像

2.3 小鼠生存指標 10只小鼠體重均值在接種細胞約13 d后出現持續下降趨勢。小鼠模型在做MRI掃描全部存活，生命狀態尚穩定，經麻醉后頸脫處死。

2.4 病理學報告 形態與原代體外細胞形態相似，程長梭形，核幼稚，細胞核深染，核異型性明顯，排列雜亂緊密，與鄰近肺組織特征完全不同(圖3)。

圖3 腫瘤組織切片(左圖：HE染色×40；右圖：HE染色×20)

3 討 論

3.1 不同肺癌動物模型優缺點 目前常用的肺癌小鼠模型有：化學誘導模型、移植模型、轉基因模型等[5]。其中移植模型按移植細胞來源分為鼠源—同種移植模型和非鼠源—異種移植模型，最多來源是人源肺癌細胞；按移植部位可分為原位和非原位，原位模型有經氣道移植，經皮移植等，非原位模型最多見為前胸部皮下、背部及腹部皮下等。

化學誘導的肺癌動物模型與移植模型、轉基因模型相比，由于其易應用，更接近癌癥發生的因果聯系，尤其是最接近人類肺癌形成、發展及轉移的方案，是研究腫瘤發生發展的最佳選擇。另外，有多項研究報道，不同化學物可誘導出不同分型的肺腫瘤[6]。為研究化學誘導的肺腺癌發生的細胞和分子變化，Spella等[7]通過腹腔注射煙草致癌物氨基甲酸酯10周，開發了C57BL/6小鼠肺腺癌模型。NNK用于誘導腺癌[8]。N-亞硝基-三氯乙基脲(NTCU)促進鱗狀細胞癌的發展[9]。Mervai等[10]通過在FVB/N小鼠菌株中使用二乙基亞硝胺誘導腺癌，開發了一種新的非小細胞肺癌(NSCLC)動物模型。吳逸明等[11]采用煤-焦瀝青(CTP)支氣管灌注的方法,誘發大鼠肺癌動物模型。歷時實驗6個月余僅出現少部分原位腫瘤，時間耗時長，成本大且造模成功率低。隨后的研究中魯植艷[12]改進方法，以改制的 ZY 型12號腰穿針插入左下葉支氣管與傳統的呼吸道給藥方法，對比造模時間明顯縮短，成功率明顯提高，但相對操作復雜，對實驗人員技術水平要求較高。

移植模型中異位移植模型是肺癌實驗研究階段首選的動物模型，由于造模操作簡單，對于臨床藥物開發及藥物毒理等研究方面具有不可替代的意義。馬雪曼等[13]在進行異位移植與原位移植造模對比研究中得出顯著結論，雖然原位移植腫瘤操作難度稍大，但成功率無明顯差異，并且原位移植動物模型在其他臟器轉移方面的研究有著不可替代的作用。原位移植模型在腫瘤微環境方面研究也具有重要意義。在臨床工作中，臨床分期為Ⅰ期、Ⅱ期的惡性腫瘤均可以手術完全切除，但很多患者仍因發生轉移而致死致殘[14]。本次實驗小鼠原位肺癌動物模型構建中我們可以觀察到腫瘤轉移的過程，與人類腫瘤轉移方式非常相似，為構建更多臟器的轉移瘤模型提供了參考，也為放射治療開展體內實驗研究提供更優平臺。文獻報道原位移植模型中經氣道移植腫瘤，存在明顯不足，實驗周期長、操作難度大、小鼠手術創傷大，存活期短等問題不可忽略[15]。異種原位移植中，人源異種移植可以很好的體現患者原有腫瘤的生物學特性[4]，是最能體現其腫瘤異質性并且是可以提供患者個性化用藥的基礎模型。但是，由于人源肺癌移植動物模型應用的實驗動物必須是免疫抑制小鼠，在研究免疫藥物方面具有一定的局限性。

轉基因模型中有代表性的是小鼠小細胞肺癌模型[16]，該模型再現了人類小細胞肺癌的關鍵特征，包括組織病理學外觀，關鍵神經內分泌標志物的表達和轉移擴散模式。佘佐亞等[17]用帶有綠色熒光蛋白轉基因構建小鼠肺癌模型，雖然22周后得到100%的造模成功率，但表現出明顯不足，就是在長時間誘癌過程中,動物早期染毒感染率高，實驗動物死亡率高,達到60% (30/50) 。轉基因模型從腫瘤進展，以及對不同類型腫瘤的控制都有優勢，但綜合分析操作難度、生存期、造模周期、個體對腫瘤免疫反應及腫瘤微環境方面，鼠源肺原位移植動物模型是在放射治療中最佳的選擇。

3.2 肺癌原位動物模型的構建及在放射治療中動物模型的意義 從動物模型的角度出發，近年來有大量研究表明腫瘤細胞對腫瘤微環境的塑造及調節有不可忽略的作用，腫瘤微環境(TME)期初由 Ioannides提出，TME在促進腫瘤細胞的生長、浸潤和轉移等方面有顯著影響，而且也在對腫瘤細胞自身生長的限制有明顯作用[18]。并且賀春艷等[19]研究發現NSCLC組織與癌旁組織對比肺癌基因如缺氧誘導因子-1α(HIF-α)的表達明顯升高，并且與腫瘤生長直徑等密切相關。岳英等[20]的實驗結果得出結論： NSCLC 患者免疫微環境中多種免疫細胞包括CD4+T細胞、CD8+T細胞、M2型巨噬細胞、PD-L1蛋白參與腫瘤的生長，并促進腫瘤的轉移。這有力的表明原位模型可以通過不同分型的惡性腫瘤的肺內移植來構建不同突變基因的肺癌模型，并且模擬TME。同樣從肺癌放療角度出發，原位動物模型與異位模型優勢也是很明顯的，異位人源肺癌模型是有著人類有相同基因的模型，在化學治療實驗上提供了巨大貢獻。但在放療實踐中，不同部位腫瘤的微環境不盡相同，這對放射治療的療效有著重要影響，大多數學者認為皮下空間的組織環境中，腫瘤的灌注和氧含量狀況與人類肺癌微環境不同。在放療中腫瘤細胞氧合程度及分次放療再氧合是至關重要的。有研究表明，在放療前通過高氧水平預處理多形性成神經膠質瘤(GBM),對輻射抵抗的腫瘤患者放療是一種安全有效的輔助治療手段。

3.3 本次肺癌原位動物模型的構建不足、注意事項及改進空間 首先，本次研究中，在種植階段未進行Matrigel基質膠與細胞懸液混合移植入小鼠肺內，可能是導致較早的肺內轉移及肺外(胸膜)轉移的原因。其次，對小鼠進行MRI掃描，采用與人體相同的MRI參數設置，對圖像質量會有一定影響，如果使用專用小鼠參數會更好；上機過程中由于小鼠負荷腫瘤并麻醉狀態對于呼吸與心臟功能的抑制，機房設備環境溫度影響導致小鼠狀態不佳，表現為呼吸淺慢、心臟搏動幅度減小次數減少，給予電加熱設備后小鼠生命狀態逐漸明顯好轉。最后，本實驗小鼠解剖后未進行原位移植瘤的腫瘤微環境與皮下異位移植腫瘤微環境的對比研究，進一步研究可能發現皮下腫瘤與原位腫瘤及不同移植腫瘤微環境的不同，在放射治療中有研究價值。

總之，本研究成功的實現了LLC細胞在C57BL/6小鼠原位肺癌荷瘤模型的構建，并運用MRI直觀體現肺內腫瘤存在及生長情況，造模成功率高，為后續開展放射治療實驗研究提供了較為理想的動物模型。但本研究實驗動物較少，未觀察模型的自然生存期，今后會繼續增加動物數量，增加多個實驗對照組，對比皮下移植模型及原位移植模型的優缺點，繼續優化構建模型方法，改進不足，滿足科學實驗要求，為放射治療研究提供最優模型。