槐枝藥材及飲片的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究

李 敏 劉 洋 鄭 鵬 于姍姍 王 亮 張秋紅*

槐枝，又名槐嫩蘗，最早收載于《名醫(yī)別錄》，為豆科槐屬植物槐Sophora japonicaL.的嫩枝[1]。其具有散瘀止血，清熱燥濕等功效，用于崩漏、心痛、赤白帶下、痔瘡等[2]?；敝υa(chǎn)中國，現(xiàn)南北各省區(qū)廣泛栽培，華北和黃土高原地區(qū)尤為多見[3]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，槐枝主要具有抗菌、抗炎作用[4-6]，化學(xué)成分主要為黃酮類化合物，以蘆丁和槲皮素為主[7-10]，近期研究從槐枝中分離得到了高麗槐素[11]，槐枝揮發(fā)油的主要成分為棕櫚酸、亞油酸和油酸等[12]。

歷版《中華人民共和國藥典》及山東省地方標(biāo)準(zhǔn)中均未收載槐枝藥材及飲片，僅在部分省級(jí)標(biāo)準(zhǔn)中收載，且檢驗(yàn)項(xiàng)目較單一，為了制定山東省中藥材地方標(biāo)準(zhǔn)，筆者收集了栽培于山東省境內(nèi)的槐枝藥材及飲片樣品各10批，制訂了性狀、鑒別、檢查、浸出物和有效成分蘆丁含量的測定方法，以槐枝藥材及飲片的質(zhì)量評價(jià)提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料

1.1 儀器

FW100型高速萬能粉碎機(jī)（天津市泰斯特儀器有限公司）；KQ-600GDV型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；MS204TS型電子天平（瑞士梅特勒-托利多儀器公司）；BX53顯微鏡（OLYMPUS）；干燥箱（BINDER）；水浴鍋；薄層成像系統(tǒng)（CAMAG TLC VISUALIZER）；LC-20A型高效液相色譜儀（二極管陣列檢測器）（島津企業(yè)管理有限公司）。

1.2 試劑

蘆丁對照品（中國食品藥品檢定研究院，100080-202012，91.6%），甲醇、冰醋酸、磷酸為色譜純，實(shí)驗(yàn)用水為哇哈哈純凈水，其他試劑均為分析純。

1.3 藥材及飲片

槐枝藥材及飲片樣品各10批，均采集自山東省內(nèi)，經(jīng)濟(jì)南市食品藥品檢驗(yàn)檢測中心張秋紅主任藥師鑒定為豆科植物槐Sophora japonicaL.的嫩枝。樣品信息見表1。

表1 樣品信息

2 方法與結(jié)果

2.1 性狀

2.1.1 槐枝藥材性狀 本品呈長圓柱形，直徑0.3～1.5 cm，外表皮暗綠色至棕褐色，可見突起類圓形皮孔及細(xì)縱紋，并有黃白色半圓形的葉痕。質(zhì)堅(jiān)硬，不易折斷。皮部較薄，形成層呈環(huán)狀，木部黃白色，髓部類白色或淺棕色。氣特異，味微苦?；敝λ幉牡男誀钜妶D1。

圖1 槐枝藥材

2.1.2 槐枝飲片性狀 呈類圓形厚片或圓柱形小段，直徑0.3～1.5 cm。外表暗綠色至灰棕色，可見突起類圓形皮孔及細(xì)縱紋。質(zhì)堅(jiān)硬，切斷面淺黃色或黃白色，皮部較薄，形成層呈環(huán)狀，木部黃白色，髓部類白色或淺棕色。氣特異，味微苦。槐枝飲片的性狀見圖2。

圖2 槐枝飲片

2.2 鑒別

2.2.1 顯微鑒別 粉末黃綠色。纖維較多，成束或單個(gè)散離，淡黃色或淺黃色，細(xì)長，平直或稍彎曲，胞腔明顯。纖維束周圍的薄壁細(xì)胞中含草酸鈣方晶，形成晶纖維。薄壁細(xì)胞呈長條形、類長方形或類方形，直徑11～43 μm。草酸鈣方晶多見，長方形或不規(guī)則形，直徑7～14 μm。石細(xì)胞散在或成群，淡黃色，呈類多角形、類方形或類長圓形，直徑17～41 μm，壁厚薄不勻，胞腔較小。非腺毛長275～480 μm，胞腔內(nèi)含黃棕色物。具緣紋孔導(dǎo)管直徑8～23 μm。主要的顯微特征見圖3。

圖3 槐枝粉末顯微特征

2.2.2 薄層色譜法鑒別 取槐枝樣品粉末2 g，加石油醚（30～60 ℃）30 ml，超聲20 min，濾過，留取濾渣，濾渣揮干后加甲醇50 ml，超聲30 min，取濾 液蒸干，殘?jiān)蛹状? ml，即得。取蘆丁對照品，加甲醇制成2 mg/ml的溶液，即得。照薄層色譜法試驗(yàn)[13-14]，吸取上述兩種溶液各2 μl，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以乙酸乙酯∶甲醇∶甲酸∶水（8∶1∶1∶1）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以三氯化鋁試液，置紫外光（365 nm）下檢視。供試品色譜中，在與對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)。薄層色譜結(jié)果顯示，槐枝藥材及槐枝飲片均含有蘆丁，但槐枝藥材的斑點(diǎn)不如槐枝飲片的斑點(diǎn)顯色清晰。見圖4。

圖4 槐枝藥材及飲片的薄層色譜

2.3 檢查

參照《中華人民共和國藥典》2020年版[13]水分測定法（通則0832，第二法）、灰分測定法（通則2302）對槐枝藥材及飲片進(jìn)行測定。見表2。

李立國與鮑學(xué)全的交集，出現(xiàn)在2006年左右。李立國早年在遼寧工作，后赴西藏，歷任自治區(qū)黨委常委、副書記，2003年，進(jìn)京任民政部副部長。2006年，李立國分管彩票工作時(shí)，鮑學(xué)全正是福彩中心主任。

表2 槐枝藥材及飲片的測定結(jié)果(%)

10批槐枝藥材的水分為5.5%～8.9%，平均值為7.1%；總灰分為3.3%～7.5%，平均值為4.3%。10批槐枝飲片的水分為9.1%～9.5%，平均值為9.3%；總灰分為4.0%～4.7%，平均值為4.4%。

參照《中華人民共和國藥典》2020年版[13]灰分測定法（通則2302），測定了10批槐枝藥材的酸不溶性灰分，結(jié)果為0.07%～0.14%，根據(jù)測定結(jié)果，暫不增加此檢查項(xiàng)目。

2.4 浸出物

取7號(hào)樣品，分別以水、30%乙醇溶液、70%乙醇溶液及乙醇作為提取溶液，考察冷浸法及熱浸法的浸出物差異，以對提取方式和提取溶液進(jìn)行優(yōu)選。水溶液熱浸法的浸出物含量最高，且經(jīng)濟(jì)環(huán)保，因此，采用水溶性浸出物測定法項(xiàng)下的熱浸法測定。

參照《中華人民共和國藥典》2020年版[13]浸出物測定法（通則2201）項(xiàng)下的熱浸法，測定水溶性浸出物，測定結(jié)果見表2。10批槐枝藥材浸出物結(jié)果在9.8%～19.6%，平均值為12.3%；10批槐枝飲片浸出物結(jié)果在18.5%～19.6%，平均值為19.1%。

2.5 含量測定

2.5.1 樣品溶液制備 取槐枝粉末（過3號(hào)篩）約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇溶液50 ml，密塞，稱定重量，超聲處理（500 W，頻率40 kHz）30 min，取出，冷卻至室溫，用50%甲醇溶液補(bǔ)足減失的量，搖勻，過濾，取續(xù)濾液，即得。

2.5.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液制備 精密稱取蘆丁對照品適量，加甲醇配制成含蘆丁0.050 7 mg/ml的溶液，作為對照品儲(chǔ)備溶液。精密吸取對照品儲(chǔ)備溶液4 ml，置10 ml量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，作為對照品溶液（C對為0.020 3 mg/ml）。

2.5.3 色譜條件 Kromasil 100-5-C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相為乙腈∶甲醇∶0.5%磷酸（13∶13∶74）；檢測波長257 nm；柱溫35 ℃。理論板數(shù)按蘆丁峰計(jì)算應(yīng)不低于3 000。

2.5.4 方法學(xué)考察

2.5.4.1 系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn) 按照2.5.3項(xiàng)下的色譜條件，分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液各10 μl注入液相色譜儀，結(jié)果表明對照品與供試品溶液在相應(yīng)的保留時(shí)間有相應(yīng)的峰形，理論塔板數(shù)按蘆丁峰計(jì)不低于3 000，系統(tǒng)適應(yīng)性符合要求。對照品和槐枝樣品高效液相色譜法（HPLC）圖譜見圖5。

圖5 對照品溶液、槐枝樣品溶液色譜

2.5.4.2 線性關(guān)系考察 精密吸取對照品儲(chǔ)備液1、2、4、8、10、15 μl進(jìn)樣，按2.5.3項(xiàng)下的色譜條件測定，以色譜峰面積為縱坐標(biāo)，以蘆丁對照品進(jìn)樣量（μg）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得蘆丁對照品的線性方程：y=2 058.3x-52.334，相關(guān)系數(shù)為r=0.999 8，線性范圍為50.7～760.6 ng。

2.5.4.3 精密度試驗(yàn) 精密吸取對照品溶液（C對= 0.020 3 mg/ml），連續(xù)進(jìn)樣6次，每次10 μl，蘆丁峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為1.4%。

2.5.4.4 重復(fù)性試驗(yàn) 取19號(hào)樣品，按2.5.1項(xiàng)下的的方法制備供試品溶液，平行操作6次，按2.5.3項(xiàng)下的色譜條件測定，蘆丁的平均含量為0.39%，RSD為1.5%。

2.5.4.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取19號(hào)樣品，按2.5.1項(xiàng)下的的方法制備供試品溶液，分別在0、1、4、8、12、24 h進(jìn)樣10 μl，蘆丁峰面積的RSD為0.2%。

2.5.4.6 準(zhǔn)確度試驗(yàn) 取19號(hào)樣品（水分為9.1%，蘆丁含量為0.39%）6份，每份約0.25 g，精密稱定，分別精密加入蘆丁對照品儲(chǔ)備液（C對= 0.050 7 mg/ml）20 ml，再精密加入甲醇5 ml、水25 ml，按2.5.1項(xiàng)下的方法制備供試品溶液，按2.5.3項(xiàng)下的色譜條件測定。蘆丁的平均回收率為103.6%，RSD為1.7%。

2.5.5 樣品測定 取收集到的10批槐枝藥材和10批槐枝飲片樣品，按照2.5.1項(xiàng)下的方法制備供試品溶液，按照2.5.3項(xiàng)下的色譜條件，測定槐枝藥材和飲片中蘆丁的含量。見表3。

表3 槐枝樣品含量測定結(jié)果(%,n=2)

試驗(yàn)結(jié)果表明，10批槐枝藥材中蘆丁的含量在0.12%～0.25%，平均含量為0.17%；10批槐枝飲片中蘆丁的含量在0.20%～0.39%，平均含量為0.26%。根據(jù)測定結(jié)果，暫定含量限度為按干燥品計(jì)，含蘆?。–27H30O16）不得少于0.50%。

3 討論

3.1 定性及定量成分的選擇

現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，槐枝含有較多的黃酮類化合物，蘆丁為其主要化學(xué)成分，具有消炎、增強(qiáng)免疫力等藥理活性[4-10]，因此，選其作為槐枝藥材及飲片的鑒別和含量指標(biāo)。

3.2 薄層色譜方法考察及結(jié)果分析

在薄層色譜鑒別研究[14]中，參照2020年版《中華人民共和國藥典》槐米的薄層鑒別方法，考察了脫色劑[乙醚、石油醚（30～60 ℃）、石油醚（60～90 ℃）]，提取方式（超聲、回流提取），薄層板廠家（青島海洋、德國Merk、煙臺(tái)銀龍），點(diǎn)樣量（2、5、10 μl），展開劑（乙酸乙酯-甲醇-水、乙酸乙酯-甲醇-甲酸-水）對薄層色譜的影響，最終確定了薄層色譜鑒別方法。

本研究薄層色譜結(jié)果顯示，槐枝藥材及槐枝飲片均含有蘆丁，但槐枝藥材的斑點(diǎn)不如槐枝飲片的斑點(diǎn)顯色清晰，提示槐枝藥材的蘆丁含量可能低于槐枝飲片的蘆丁含量。

3.3 檢查項(xiàng)及浸出物結(jié)果分析

根據(jù)測定結(jié)果，建議槐枝藥材及飲片的水分限度為不超過12.0%，總灰分限度為不超過10.0%，水溶性浸出物限度為不得少于8.0%。暫不增加酸不溶性灰分檢查。

3.4 HPLC方法考察及結(jié)果分析

在HPLC測定的提取過程中，分別考察了提取溶劑（甲醇、50%甲醇溶液、50%乙醇溶液、70%乙醇溶液）、提取方法（靜置過夜、超聲提取、加熱回流提?。?、提取時(shí)間（30 min、40 min、60 min），選定50%甲醇溶液，超聲處理30 min為樣品制備條件。然后，采用二極管陣列檢測器在200～400 nm波長下進(jìn)行掃描，采集光譜圖，通過觀察光譜圖發(fā)現(xiàn)，蘆丁在257 nm和355 nm波長處均有最大吸收，但在257 nm下采集的色譜圖，蘆丁的基線更平穩(wěn)，色譜峰的分離度更好，因此選擇蘆丁的測定波長為257 nm。又分別考察了流動(dòng)相[甲醇-1%冰醋酸溶液（32∶68）、乙腈-2.5%冰醋酸溶液（13∶87）、甲醇-0.01 mol/L乙酸銨溶液（47∶53）、乙腈∶甲醇∶0.5%磷酸溶液（13∶13∶74）]、色譜柱（Kromasil 100-5-C18、Agilent Zorbax SB C18、VP-ODS C18）、流速（0.8、1.0、1.2 ml/min）、柱溫（25 ℃、30 ℃、35 ℃），選定乙腈∶甲醇∶0.5%磷酸溶液（13∶13∶74）為流動(dòng)相，流速1.0 ml/min，柱溫35 ℃作為HPLC檢測條件。

槐枝藥材的蘆丁含量普遍低于槐枝飲片的蘆丁含量，印證了薄層色譜鑒別的猜測。說明炮制過程提高了槐枝中蘆丁的提取含量，參考槐米的炮制過程[15]，合適的炮制溫度會(huì)提高槐米中總黃酮類成分的含量。因此，選擇合適的炮制溫度及時(shí)間，可以提高槐枝飲片中有效成分蘆丁的含量。

本文對槐枝藥材及飲片進(jìn)行了性狀、顯微鑒別及薄層色譜鑒別、水分及總灰分檢查、水溶性浸出物檢查并進(jìn)行了槐枝中蘆丁HPLC定量測定方法的考察，初步完成了槐枝藥材及飲片質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究，但在農(nóng)藥殘留及有害元素等方面的控制與安全評價(jià)還有待于進(jìn)一步研究，不斷完善其質(zhì)量方案。