基于網(wǎng)絡藥理學探究冰清膏促進深Ⅱ度燒傷創(chuàng)面愈合的作用機制

趙建偉 張文賢 林德民 嚴其凱 王守國 王世杰

[摘要]目的基于網(wǎng)絡藥理學方法探究冰清膏促進深Ⅱ度燒傷創(chuàng)面愈合的作用靶點及信號通路，探索其作用機制。方法該研究利用中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫和分析平臺（TCMSP）篩選冰清膏的活性成分和中藥靶標，使用蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫（Uniprot）進行基因名注釋，并在基因名片數(shù)據(jù)庫（GeneCards）中檢索“深Ⅱ度燒傷創(chuàng)面愈合”的相關疾病靶點，利用Cytoscape 3.8.2軟件，構(gòu)建中藥-活性成分-靶點網(wǎng)絡，并采用蛋白質(zhì)相互作用檢索數(shù)據(jù)庫（String）構(gòu)建蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡（PPI），利用生物信息分析數(shù)據(jù)庫（DAVID）進行潛在作用靶基因的基因功能富集分析（GO）及通路富集分析（KEGG）。結(jié)果篩選出冰清膏146個化合物和191個作用于深Ⅱ度燒傷的蛋白靶點，通過網(wǎng)絡拓撲特征評價篩選出25個冰清膏促進深Ⅱ度燒傷創(chuàng)面愈合重要靶點;GO 分析顯示富集到生物學過程764個、細胞組分75個、分子功能149個;KEGG 通路富集篩選64條主要通路在促進深Ⅱ度燒傷創(chuàng)面愈合方面具有作用。結(jié)論通過網(wǎng)絡藥理學預測了冰清膏促進深Ⅱ度燒傷創(chuàng)面愈合潛在的作用機制，為進一步的活性成分研究和實驗研究提供理論依據(jù)。

[關鍵詞]冰清膏;深Ⅱ度燒傷創(chuàng)面愈合;網(wǎng)絡藥理學;作用機制

[中圖分類號] R644? [文獻標識碼] A?? [文章編號]2095-0616（2022）09-0023-05

Investigation on the mechanism of action of Bingqing Ointment in the promotion of deep second-degree burn wound healingbased on network pharmacology

ZHAO? JianweiWANG? Shijie1ZHANGWenxianLINDeminYANQikai1WANGShouguo1

1. Clinical College ofTraditional Chinese Medicine， Gansu University of Chinese Medicine， Gansu， Lanzhou 730000， China;

2. Emergency Orthopedics， Gansu Provincial Hospital ofTraditional Chinese Medicine， Gansu， Lanzhou 730000， China

[Abstract] Objective The targets， signaling pathways， and their mechanism of action of Bingqing Ointment in the promotion of deep second-degree burn wound healing were explored based on the network pharmacology method. Methods The active ingredients and traditional Chinese medicine targets of Bingqing Ointment were screened by Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform. The annotation for gene names was performed with the protein database Uniprot. The related disease targets of "deep second-degree burn wound healing" were searched in the GeneCards database. The TCM-active ingredient- target network was constructed by the Cytoscape 3.8.2 software. The protein-protein interaction was constructed by the protein interactions search database String. Gene ontology （GO） function enrichment and Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes （KEGG） pathway enrichment analysis of the potential target genes were carried out by using the biological information annotation database DAVID. Results A total of 146 compounds of Bingqing Ointment and 191 protein targets involved in the deep second-degree burn were screened out， and25 important targets of Bingqing Ointment for promoting deep second-degree burn wound healing were screened out based on the evaluation of network topology features. GO analysis showed that 764 biological processes，75 cellular components and 149 molecular functions were enriched.64 major pathways that function in the promotion of deep second-degree burn wound healing were screened by KEGG pathway enrichment analysis. Conclusion This study predicts the potential mechanism of action of Bingqing Ointment in the promotion ofdeep second-degree burn wound healing through network pharmacology， which provides a theoretical basis for further active ingredient research and experimental research.

[Key words] Bingqing Ointment; Deep second-degree burn wound healing; Network pharmacology; Mechanism of action

燒傷一般是指熱力因素引起的皮膚組織損傷，另外化學燒傷、輻射灼傷等發(fā)生的頻率也不斷增高[1]。深Ⅱ度燒傷傷及真皮乳頭層及部分網(wǎng)狀層，較多的組織失活，傷口愈合速度慢，容易引發(fā)感染[2]。目前臨床治療燒傷多采用藥物及各種物理療法，雖可取得一定療效，但創(chuàng)面愈合的效果仍不令人滿意。

冰清膏來源于民間驗方，由冰片、虎杖、大黃、黨參、黃芪、蒲公英、紫草、地榆以及雞蛋清組成，其功效主要為清熱活血、生肌去腐、解毒化瘀。臨床試驗中，在減輕患者疼痛，促進創(chuàng)面愈合方面有較好的效果（專利號：Z L201711075825.X）。為研究其作用機制，本課題組采用網(wǎng)絡藥理學方法，挖掘冰清膏促進深Ⅱ度燒傷創(chuàng)面愈合的活性成分，預測其作用靶點及相關信號通路，探討冰清膏促進深Ⅱ度燒傷創(chuàng)面愈合的作用機制，后期通過動物實驗進行驗證，以期為冰清膏的開發(fā)與利用提供理論基礎。

1材料與方法

1.1中藥潛在化學成分數(shù)據(jù)的整理與篩選

在 TCMSP 中以類藥性（Drug-likeness， DL）≥0.18篩選冰片、大黃、黨參、地榆、虎杖、黃芪、紫草的潛在活性成分。同時通過文獻查閱匯總蒲公英與雞蛋清所有活性成分[3-4]，并通過SwissADME篩選其潛在活性成分。

1.2預測并構(gòu)建成分靶點集

在 TCMSP 中搜索各活性成分對應的蛋白靶點，去重后獲得冰片、大黃、黨參、地榆、虎杖、黃芪、紫草的作用靶點。在Uniprot數(shù)據(jù)庫中將上述靶點經(jīng)基因名稱轉(zhuǎn)換。蒲公英與雞蛋清經(jīng)篩選成分從 PubChem 數(shù)據(jù)庫中搜集其 SMILE 結(jié)構(gòu)式。利用SwissTargetPrediction數(shù)據(jù)庫預測成分靶點。利用Cytoscape 3.8.2生物信息分析軟件構(gòu)建藥物成分-靶點網(wǎng)絡圖。

1.3深Ⅱ度燒傷的疾病靶點預測

在GeneCards數(shù)據(jù)庫中檢索關鍵詞“deep? second degree burn wound healing”，查詢與深Ⅱ度燒傷相關的基因，并篩選相關性分數(shù)（relevance score）≥1的基因，得到深Ⅱ度燒傷疾病靶點。

1.4冰清膏活性成分與深Ⅱ度燒傷的共同靶點篩選及PPI網(wǎng)絡的構(gòu)建

將冰清膏靶點與深Ⅱ度燒傷靶點進行對比分析，以兩者交集作為冰清膏治療深Ⅱ度燒傷的作用靶點。在 String 網(wǎng)站中導入上述分析獲得的基因靶點，把物種設定為“Homo sapiens”，交互作用評分>0.4，獲得 PPI 結(jié)果。將該結(jié)果導入Cytoscape 3.8.2軟件中，通過 Analyze Network 進行拓撲分析，并按照自由度（Degree 值）大小篩選關鍵靶點。

1.5 GO富集分析與KEGG通路富集分析

通過功能富集分析在線數(shù)據(jù)庫（DAVID）對關鍵靶點蛋白進行 GO 功能與 KEGG 通路富集分析，另外采用Cytoscape 3.8.2構(gòu)建冰清膏治療深Ⅱ度燒傷靶點-KEGG 通路網(wǎng)絡圖，預測冰清膏對深Ⅱ度燒傷創(chuàng)面愈合的潛在作用機制。

2結(jié)果

2.1冰清膏候選化學成分信息及篩選結(jié)果

篩選共得到146種活性化學成分，經(jīng)Uniprot基因名稱轉(zhuǎn)化后獲得靶點基因，將雞蛋清、蒲公英的活性成分的結(jié)構(gòu)式導入SwissTargetPrediction獲取靶點基因，將所有結(jié)果匯總?cè)ブ睾蠊搏@得427個作用靶點，采用Cytoscape 3.8.2構(gòu)建“中藥-化學成分-作用靶點”網(wǎng)絡圖，見圖1，網(wǎng)絡圖中包含9個中藥節(jié)點，146個化合物節(jié)點，427個作用靶點節(jié)點和2474條邊。其中四邊形代表作用靶點，圓形代表中藥，六邊形代表活性成分。

2.2冰清膏治療深Ⅱ度燒傷靶點的篩選結(jié)果

在GeneCards數(shù)據(jù)庫中篩選出1125個疾病相關靶點，將冰清膏活性成分的預測靶點和深Ⅱ度燒傷相關靶點共同映射，尋找兩者共同靶點，結(jié)果共獲得191個共同靶點。

2.3蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡（PPI）的構(gòu)建和關鍵靶點篩選

通過 String 網(wǎng)站在線分析得到 PPI 網(wǎng)絡，將數(shù)據(jù)導入Cytoscape 3.8.2后共得到191個節(jié)點，4857條邊，經(jīng)拓撲分析后節(jié)選 Degree ≥95的靶點作為冰清膏治療深Ⅱ度燒傷的核心靶點。結(jié)果構(gòu)建的 PPI 網(wǎng)絡共有25個節(jié)點，199條邊，其中色彩越深，節(jié)點越大，Degree 值越高，相互作用越密切，見圖2。

2.4 GO富集分析與KEGG通路富集分析結(jié)果

GO 富集分析顯示，生物學過程（biologial process， BP）分析結(jié)果764個;細胞組分（cellular component， CC）分析結(jié)果75個;分子功能（molecular fuction， MF）分析結(jié)果149個。見圖3。

KEGG 分析得到130個通路，篩選得到64條與深Ⅱ度燒傷有關的通路。通過微生信網(wǎng)站處理富集分析結(jié)果，其中，Y 軸代表通路名稱;X 軸代表富集因子;氣泡大小代表屬于這個通路的目標基因數(shù)量，顏色代表富集顯著性。見圖4。

2.5繪制“中藥復方-成分-靶點-通路-疾病”網(wǎng)絡圖

將 KEGG 分析結(jié)果整理后導入Cytoscape 3.8.2繪制“中藥復方-成分-靶點-通路-疾病”網(wǎng)絡圖。包括中藥復方1個，成分108個，靶點147個，通路64條，疾病1個。根據(jù) Degree 值由高到低篩選核心成分、靶點以及通路，見圖5，圖中節(jié)點越大、顏色越深其作用越強。

3討論

本研究借助網(wǎng)絡藥理學手段，構(gòu)建冰清膏的“成分-靶點-疾病”生物信息學網(wǎng)絡，初步探究該藥促進深Ⅱ度燒傷創(chuàng)面愈合的相關機制。現(xiàn)代藥理學研究發(fā)現(xiàn)冰清膏中組分主要具有抑菌抗炎、調(diào)節(jié)微循環(huán)、抗氧化、促進免疫功能調(diào)節(jié)、促進傷口愈合等作用。

本研究篩選得到的冰清膏中108個具有促進深Ⅱ度燒傷創(chuàng)面愈合的化合物，部分成分的有效性已被證實，根據(jù)圖5可知槲皮素（MOL000098）、芹菜素（MOL000098）、大黃素（MOL000472）等是關鍵活性成分。研究顯示，槲皮素具有抗炎抑菌及抗氧化等多種生物活性[5]，此外槲皮素可使 IL-1、IL-6、 IL-10等炎癥因子的表達量降低[6]，抑制 p38/MAPK 通路相關因子的表達而達到抗炎效果[7]。芹菜素可上調(diào)表皮生長因子（epidermal growth factor， EGF）、堿性成纖維細胞因子（basic fibroblast growth factor， b-FCF）、血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）蛋白表達[8]，能夠顯著提高抗氧化酶活性并降低 TNF-α、IL-1β、IL-6含量，從而促進深Ⅱ度燒傷創(chuàng)面愈合[9]。大黃素具有抑菌抗炎、抗病毒、抗氧化、穩(wěn)定內(nèi)環(huán)境等多種功能[10]，能促進 EGF、 VEGF 表達，皮膚表皮細胞及毛細血管生成，有助于傷口愈合[11]。

蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡分析得到的 AKT1、IL-6、 TNF、VEGFA、LI-1β等核心靶點蛋白均與炎癥、血管生成、生長因子有關，均被大量研究所證實，這可能是深Ⅱ度燒傷創(chuàng)面愈合的重要作用靶點。AKT1是腫瘤血管成熟、細胞外基質(zhì)組成和血管生成的關鍵調(diào)節(jié)劑，在生長因子和細胞因子的刺激下被激活，是創(chuàng)面愈合過程中血管生成及成熟所必需的成分[12]。IL-6具有促炎和抗炎作用，用以激活免疫反應，尤其是燒傷或其他損傷導致的炎癥。TNF-α和 IL-1β會抑制轉(zhuǎn)化生長因子-β（transforming growth factor-β， TGF-β）誘導的 p38/MAPK 通絡的激活，導致神經(jīng)生長因子（nerve growth factor， NGF）表達的降低，從而延緩傷口的愈合[13]。 VEGFA 是 VEDF 家族中的一員，具有促進新生血管形成和增加血管通透性的能力。

另外冰清膏候選作用深Ⅱ度燒傷靶基因 KEGG 顯著富集通路涉及 TNF 信號通路、HIF-1信號通路、FoxO信號通路、PI3K/AKT 信號通路、MAPK 信號通路等。目前研究表明，TNF 介導了機體內(nèi)廣泛的細胞反應，包括凋亡、炎癥、免疫反應等，可引發(fā)多種下游通路[14]。HIF-1是與缺氧適應及炎癥發(fā)展等密切相關的因子，曾勇等[15]研究發(fā)現(xiàn) HIF-1α可以在 p38/MAPK 與 PI3K 的共同作用下上調(diào) VEGF 的表達，從而刺激血管再生，加快創(chuàng)面愈合速度。FoxO參與細胞代謝、增值、遷移、凋亡和血管生成的進展[16]，PI3K/AKT 是FoxO的上游靶點，其具有抑制細胞凋亡，參與控制細胞生長和增殖[17]，還對血管生成有促進作用[18]，李為明等[19]研究顯示 PI3K/AKT 通路可以影響 IL-1β、TNF-α與 TGF-β的表達，并下調(diào) HIF-1α使創(chuàng)面愈合得到加速。另外有研究顯示 MAPK 信號通路的級聯(lián)被認為是誘導大鼠燒傷皮膚組織炎癥的核心信號通路[20]。各種原因?qū)е?p38/MAPK 的高表達，會誘發(fā)炎癥因子 TNF-α、IL-1β及 IL-6異常分泌而加重炎癥反應。阻斷 p38/MAPK 通路活化則會介導全身炎癥反應水平更快下降。可以推斷出 p38/MAPK 是炎癥反應中一條重要通路，在創(chuàng)面愈合也扮演重要角色[21]。因此，冰清膏可能在炎癥、細胞生長與增殖、血管生成等方面發(fā)揮作用，從而促進深Ⅱ度燒傷創(chuàng)面愈合。

綜上所述，本研究利用中藥網(wǎng)絡藥理學的方法，在理論上初步對冰清膏促進深Ⅱ度燒傷創(chuàng)面愈合的作用機制進行了系統(tǒng)分析。結(jié)果證實了中藥治療疾病多成分、多靶點、多通路的特點，為后續(xù)冰清膏進一步的藥理機制分析和實驗研究提供了理論支持。但中藥復方個味中藥的劑量，并通過炮制、煎煮等過程，其藥效成分發(fā)生變化，藥理作用也不單是僅通過網(wǎng)絡藥理學分析就可得出結(jié)論，因此，后續(xù)需要對本研究結(jié)果在藥物實驗以及臨床應用中加以驗證。

[參考文獻]

[1] Jeschke MG，van Baar ME，Choudhry MA，et al.Burninjury[J].Nat Rev Dis Primers，2020，6（1）：11.

[2]華若岳.重組人表皮生長因子在面部深Ⅱ度燒傷創(chuàng)面修復中的應用研究[J].中國美容醫(yī)學，2019，28（2）：36-38.

[3]聶文佳，徐帥師，張詠梅.蒲公英有效成分及其藥理作用研究進展[J].遼寧中醫(yī)藥大學學報，2020，22（7）： 140-145.

[4]梁艷.雞蛋清中三種蛋白質(zhì)的連續(xù)化提取研究[D].西安：陜西科技大學，2006：65.

[5] Li Y，Yao J，Han C，et al.Quercetin， Inflammation andImmunity[J].Nutrients，2016，8（3）：167.

[6]周霄楠，韓超，宋鵬琰，等.木犀草素和槲皮素體外抗炎作用研究[J].動物醫(yī)學進展，2017，38（10）：56-61.

[7]王象鵬，謝文鵬，畢亦飛，等.基于 p38 MAPK 信號通路分析槲皮素保護骨性關節(jié)炎關節(jié)軟骨的機制[J].中國實驗方劑學雜志，2021，27（7）：169-177.

[8]許岡躍，陳驊.芹菜素對深Ⅱ度燒傷創(chuàng)面愈合的影響及機制研究[J].中國中醫(yī)藥科技，2021，28（5）：716-719.

[9]童海東，陳驊.芹菜素對深Ⅱ度燒傷創(chuàng)面氧化應激和炎癥反應的影響及機制研究[J].中國中醫(yī)藥科技，2021，28（4）：560-564.

[10] Jing D，Bai H，Yin S.Renoprotective effects of emodinagainst diabetic nephropathy in rat models are mediated via PI3K/Akt/GSK-3β and Bax/caspase-3 signaling pathways[J].Experi-mental & Therapeutic Medicine，2017，14（5）：5163.

[11] 周麗艷，高露文.大黃素對大鼠燙傷創(chuàng)面模型皮膚表皮細胞增殖作用研究[J].中華中醫(yī)藥學刊，2019，37（11）：2806-2809，2832-2833.

[12] Somanath PR， Chen J，Byzova TV.Akt1 is necessaryfor the vascular maturation and angiogenesis during cutaneous wound healing[J].Angiogenesis，2008，11（3）：277-288.

[13] Ohta M，Chosa N，Kyakumoto S，et al.IL-1β andTNF-α suppress TGF-β-promoted NGF expression in periodontal ligament-derived fibroblasts through inactivation of TGF-β-induced Smad2/3-and p38 MAPK-mediated signals[J].Int J Mol Med，2018，42（3）： 1484-1494.

[14] 王文珊，傅冷西，葉君健.TNF-α信號傳導通路的研究進展[J].福建醫(yī)科大學學報，2005，39（B8）：27-31.

[15] 曾勇，簡華剛，高兵，等.胰島素外用對糖尿病大鼠深Ⅱ度燒傷創(chuàng)面 HIF-1α及 VEGF 表達的影響[J].重慶醫(yī)科大學學報，2010，35（6）：860-864.

[16] Wu L，Li H，Jia CY，et al.MicroRNA-223 regulatesFOXO1 expression and cell proliferation[J].FEBS Lett，2012，586：1038-1043.

[17] Noorolyai S，Shajari N，Baghbani E，et al .Therelation between PI3K/AKT signalling pathway and cancer[J].Gene，2019，698：120-128.

[18] Wang J，Wu M.The up-regulation of miR-21 bygastrodin to promote the angiogenesis ability of human umbilical vein endothelial cells by activating the signaling pathway of PI3K/Akt[J].Bioengineered，2021，12（1）：5402-5410.

[19] 李為明，許青文，李奕俊，等.深層海水通過激活PI3K/Akt 通路促進糖尿病小鼠創(chuàng)傷的愈合[J].中國組織工程研究，2022，26（5）：756-761.

[20] Li K，F(xiàn)an Y，Xu Z，et al.Role of AhR and Foxo1in skin inflammation in burn animal model via MAPK signaling pathway[J].Cell Mol Biol （Noisy-le-grand），2020，66（2）：53-58.

[21] 段建興，劉文軍，曾躍勤，等.肝臟 p38MAPK/NF-κB通路在大鼠燒傷休克期切痂以減輕炎癥反應中的作用[J].感染、炎癥、修復，2020，21（1）：16-21.

（收稿日期：2021-10-12）