不同類型甘薯品種遺傳多樣性的ISSR分析

崔晨珂， 林濤， 安艷波， 崔鵬

（浙江農林大學現代農學院，杭州 311300）

甘 薯（Ipomoea batatasL.）屬 旋 花 科（Convolvulaceae），其不僅是重要的糧食，也是重要的飼料工業原料及新型能源作物。我國是甘薯生產大國，產量占世界總產量的67.3%[1]。中國甘薯品種審定專業委員會按照用途將甘薯品種劃分為5個類型：食用型、淀粉型、兼用型、特用型和葉菜型。食用型品種注重外觀、食味和營養價值，主要用于蒸煮和烘烤加工；淀粉型品種的干率和淀粉含量較高，主要用于淀粉加工；兼用型是指其既可以食用，也可進行淀粉加工和飼料加工；特用型主要是類胡蘿卜素和花青素含量較高的品種，主要用于天然色素提取；葉菜型主要以莖尖和幼嫩葉片為蔬菜進行食用和種植[2]；而觀賞型是近年來新增加的甘薯分類類型，側重于其地上部分的顏色和形狀，主要用于觀賞。隨著甘薯產業發展，甘薯分類逐步趨于細化，例如觀賞型又可分為觀葉型、觀花型、觀根型、藥用觀賞型等[3]；鮮食型又可分為鮮食、烘烤、蒸煮和水果型以及薯脯加工型。目前，我國甘薯育種取得了較大進步，已經育成徐薯18、煙薯25、廣薯87和心香等優良品種，包括淀粉型、鮮食型、兼用型等類型。但甘薯遺傳基礎仍非常狹窄,沖繩100和南瑞苕多次作為親本被應用于雜交育種[4]，這極大地限制了品種遺傳改良的發展。因此，利用分子標記研究甘薯品種間的遺傳差異,對提高雜種優勢利用率具有十分重要的意義。

目前，分析品種遺傳多樣性常用的分子標記在主要包括 AFLP（amplified fragment length polymorphism）、RAPD（random amplified polymorphic DNA）、SSR（simple sequence repeat）、SRAP（sequencerelated amplified polymorphism)、SNP（single nucleotide polymorphism）和 ISSR（inter-simple sequence repeat）等。Wadl等[5]通過SNP技術對來自8個不同地區419個甘薯品種進行了分析，結果表明，樣品遺傳多樣性與地區差異有關，而地區差異又與種群結構密切相關。Yada等[6]采用405對SSR引物對New Kawogo×Beauregard親本及其后代采集到133個有效多態性位點，表明SSR適宜甘薯遺傳多樣性鑒定。Wang等[7]采用EST-SSR標記豐富了甘薯數量和質量性狀特性。劉中華等[8]采用SRAP標記在遺傳距離為0.18處較好的區分了野生種、地方種和育成品種。此外，還有學者對不同菜用、觀賞以及食用甘薯品種進行了遺傳多樣性分析，均能較好地區分品種間的遺傳差異[9-11]。

ISSR具有穩定性好、多態性高、精確度高、通用性強等較多優點。李強等[4]利用ISSR標記對中國甘薯的親本進行了遺傳差異分析，Huang等[12]利用ISSR標記同時分辨了甘薯種間和種內的遺傳多樣性，表明該標記技術在植物的親緣關系、甘薯遺傳多樣性以及系譜關系等方面有很高的分辨力。本研究擬利用ISSR分子標記方法，從品種類型特性角度對來自全國各地的37個不同類型的優良甘薯品種遺傳多樣性進行分析，判定其親緣關系的遠近，優先選擇遺傳距離較遠的育種親本可以提高遺傳變異的程度，該結果為甘薯雜交育種提供更多的理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

37份甘薯品種（表1）的薯塊購自相關育種單位，鮮食型品種可溶性糖接近40%；淀粉型品種淀粉含量接近30%；兼用型品種風味口感一般，可溶性糖含量在20%左右，硬度較高。所有材料于2020年3月10日在浙江農林大學平山溫室大棚進行常規種植，4月22日采摘新鮮幼嫩甘薯葉片，液氮速凍后于-80℃冰箱保存備用。

表1 37份供試材料的特點和來源Table 1 Characteristics and geographic origins of 37 sweetpotato varieties 續表Continued

表1 37份供試材料的特點和來源Table 1 Characteristics and geographic origins of 37 sweetpotato varieties

1.2 試驗方法

1.2.1 DNA提取和PCR擴增 采用植物基因組提取試劑盒（Cat.No.3201050，Simgen）提取甘薯葉片DNA。

PCR反應體系：Taq酶Mix（Takara公司）10 μL，ISSR 引 物（10 μmol·L-1）和 模 板 DNA（100 ng·μL-1）分別添加1 μL。PCR反應程序：94 ℃ 5 min；94 ℃ 45 s，50～60 ℃ 1 min，72 ℃1.5 min，40個循環；72℃ 7 min，4℃保存。100條ISSR引物[13]由Invitrogen公司合成，其他所用生化試劑購自上海生工生物公司。擴增產物用2%瓊脂糖凝膠分離，利用TANON凝膠電泳圖象軟件拍攝，并分析電泳結果。

1.2.2 數據統計 根據每條引物擴增產物片段的大小進行統計。用數字“1”和“0”分別表示供試材料某一等位基因的有和無，有記為“1”，無記為“0”，用Excel對37份材料的擴增結果建立“1/0”數據庫。利用NTsys2.10e軟件進行Jaccard（J）遺傳相似性系數分析，利用非加權類平均法（unweight pairgroup method using arithmetic averages，UPGMA）構建37個甘薯品種的遺傳關系聚類圖。

2 結果與分析

2.1 ISSR標記擴增結果分析

引物篩選結果（圖1）表明，甘薯品種親緣關系較近，100條ISSR引物中篩選出19條具有多態性引物。篩選的引物擴增條帶清晰，多態性明顯，表明ISSR方法能有效的應用于甘薯遺傳多樣性分析。

圖1 引物UBC850對37個品種的擴增帶型Fig.1 ISSR-PCR profiles of 37 sweetpotato variety with UBC850 primer

2.2 ISSR標記多態性分析

經統計分析（表2），利用篩選獲得的19條引物共擴增出118條帶，其中多態性條帶115條，多態性位點頻率為97.5%。引物UBC821擴增條帶數最少，為3條；引物UBC850擴增條帶數最多，達8條。19條引物擴增的平均多態性帶數為6條，其分子量一般在200～2 000 bp之間。多態性位點頻率最低的引物是UBC811和UBC848，為80%，其次是UBC842（83%），其他引物的多態性位點頻率均達100%，表明每個品種之間均有多態性差異。

表2 引物序列及擴增結果Table 2 Amplification efficiency of different primers

2.3 聚類結果分析

37份不同甘薯品種中涉及鮮食、淀粉和菜用等共9個類型。雖然薯脯加工型和水果型從廣義分類均屬于鮮食型，但隨著薯類產業分工不斷細化，這2種類型已經逐漸成為獨立類型。根據ISSR分子標記統計結果，試驗涉及甘薯品種的遺傳距離介于0.04～0.36之間，平均遺傳距離為0.14（圖2）。遺傳距離0.36處，劃分為2類，第1類包含紫羅蘭、徐紫薯8號和徐紫薯2號等31個品種，第2類包含秦薯5號和廣薯87等6個品種。其中第1類在0.32處，以紅東和冀紫薯2號為分界點又分為2個亞類，分別包含紫羅蘭等17個和冀紫薯2號等14個鮮食品種。其中，臺薯66和紅東的遺傳距離最近，僅為0.04，二者均屬薯脯加工型，商薯19和商薯8號的遺傳距離為0.05，均屬于淀粉型，紅香蕉和煙薯25屬于典型的鮮食型甘薯品種，遺傳距離也較近，為0.06。觀賞型甘薯品種紫羅蘭，與花青素加工型徐紫薯8號聚為一類（0.08），二者薯肉均呈紫色，由此可見，ISSR能很好地區分不同類型的甘薯品種。

圖2 基于ISSR數據的37份甘薯品種聚類分析結果Fig.2 Clustering analysis of 37 sweetpotato varieties based on the results of ISSR data

2.4 遺傳距離分析

根據ISSR聚類分析得出9種類型甘薯的遺傳距離（圖3），可以看出，花青素加工型與菜用型和水果型的遺傳距離最遠，分別為0.434和0.401，與觀賞型遺傳關系最近，距離為0.077，水果型與其他8種類型的遺傳關系較遠，遺傳距離均大于0.300，而鮮食型品種大多適用于蒸煮或烘烤，除與菜用型和水果型的遺傳關系稍遠之外（分別為0.346和0.368），與其他6種類型的遺傳距離均較近。表明鮮食型品種數量較多，其親本來源類型相對廣泛，而菜用型、觀賞型和花青素加工型品種數量少，品種親本類型狹窄。

表3 不同類型甘薯品種間的平均遺傳距離Table 3 Mean genetic distances among different types of sweetpotato varieties

3 討論

甘薯既可以作為糧食作物，也可以是能源和飼料加工原料，使用目的不同，對其品質要求也不同。結合經濟性狀和營養成分等數據對甘薯品種進行系統分類[14-15]，可以作為親本選擇的依據，但同一類型的不同品種之間還是存在一些差異，不能很好地按用途分類來指導親本選擇。ISSR分子標記進行擴增時不需要知道DNA序列，在引物設計上也比SSR標記更簡單[16]，且能揭示比AFLP、RAPD和SSR分子標記更豐富的多態性，現已廣泛應用于遺傳作圖、基因定位、遺傳多樣性及系統發育等研究領域[1,17]。本研究從甘薯類型分析，37份材料中有鮮食型16份、水果型4份、淀粉型和兼用型各5份、薯脯加工型4份、菜用型和花青素加工型和觀賞型各1份，由聚類結果可知，不同類型的甘薯品種均能夠各自聚為一類，不同類型甘薯可以明顯被區分（圖2），表明ISSR分子標記是適用于甘薯資源遺傳多樣性分析的理想分子標記。

本研究中菜用型和觀賞型的遺傳距離較遠，為0.379，與蘇一鈞等[3]的研究結果一致。季志仙等[9]通過ISSR分子標記，說明甘薯食用品種間遺傳多樣性是比較豐富的，本研究中的16個鮮食型品種聚為一類，其遺傳距離與其他類型較近，表明其他類型甘薯品種為鮮食型甘薯品種遺傳改良與育種創新提供了較好的背景材料。同時，同一類型下的不同品種間遺傳距離也較遠，表明這些品種資源間存在豐富的遺傳多樣性[18-20]。此外，本研究中的觀賞型品種紫羅蘭與花青素加工型品種徐紫薯8號遺傳關系最近，且紫羅蘭的的親本不詳，推測其二者的親本來源相似[21]。