三種芽孢桿菌菌劑對烤煙育苗效果的影響

肖雨沁， 雷曉， 張明金， 張遠(yuǎn)蓋， 唐珊，姬鴻飛， 王川， 馬翠玲， 景延秋

（1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)煙草學(xué)院，鄭州 450001；2.四川省煙草公司瀘州市公司，四川 瀘州 646000）

煙草是我國重要的經(jīng)濟(jì)作物，而育苗是煙草生產(chǎn)的必要環(huán)節(jié)之一，能否培育壯苗直接影響烤煙的產(chǎn)量與品質(zhì)。在川南植煙地區(qū)，煙農(nóng)每年均按照生產(chǎn)章程進(jìn)行育苗，在育苗方法上少有創(chuàng)新，大幅度改變育苗方式需要一定時(shí)間的過渡，且烤煙的品質(zhì)和產(chǎn)量無法得到保障。評價(jià)壯苗的關(guān)鍵指標(biāo)是在成苗期煙草是否擁有發(fā)達(dá)的根系。目前，在實(shí)際生產(chǎn)中從基質(zhì)上改良漂浮育苗營養(yǎng)液的配置是有效提高煙草幼苗期根系發(fā)育狀況的手段之一。研究表明，在烤煙漂浮育苗和栽培中應(yīng)用微生物菌肥，有利于提高發(fā)芽率和成苗素質(zhì)［1］；施用微生物菌劑對烤煙不同時(shí)期的農(nóng)藝性狀（如葉面積指數(shù)和最大葉面積）具有不同程度的促進(jìn)作用［2］，還能夠有效促進(jìn)煙草的生長發(fā)育［3］，對根系發(fā)育也具有一定的促進(jìn)作用。

側(cè)孢芽孢桿菌（Brevibacillus laterosporus）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）和地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）均屬于微生物菌劑，是芽孢桿菌屬中具有生防應(yīng)用價(jià)值的拮抗細(xì)菌。芽孢桿菌能改良土壤，使土壤肥力、微生物活性及種群結(jié)構(gòu)得到明顯改善，同時(shí)促進(jìn)農(nóng)作物根系生長發(fā)育，增強(qiáng)農(nóng)作物的抗病能力［4］。

抗氧化酶是防御氧化物和自由基損害的酶，包括超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、過氧化物酶（peroxidase，POD）和過氧化氫酶（catalase，CAT）等。陳曉晶等［5］通過對燕麥根系進(jìn)行鹽脅迫發(fā)現(xiàn)，抗氧化酶活性的高低是體現(xiàn)植物抗逆性的重要指標(biāo)。王宇辰等［6］發(fā)現(xiàn)，可溶性蛋白（soluble proteins，SP）是煙草根系細(xì)胞中重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，對維持細(xì)胞膨壓、保持抗氧化酶活性具有重要作用。丙二醛（malondialdehyde，MDA）是細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化作用的產(chǎn)物，其含量的高低反映了植物遭受逆境傷害的程度［7］。目前，國內(nèi)外對烤煙移栽后根系發(fā)育的生理特性進(jìn)行了大量研究，但對微生物菌劑在煙草幼苗期根系發(fā)育和抗氧化酶活性影響的研究較少，且后期移栽之后對烤煙品質(zhì)的跟進(jìn)尚未見報(bào)道。因此，本研究通過研究3種微生物菌劑對煙草幼苗根系發(fā)育的影響，發(fā)掘在實(shí)際煙草漂浮育苗效果最佳的微生物菌類，旨在促進(jìn)煙草幼苗根系發(fā)育、提高根系活力，為培育壯苗及提升煙葉品質(zhì)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

試驗(yàn)于2020年2—9月在四川省瀘州市古藺縣大寨苗族鄉(xiāng)大寨煙站（海拔1 156 m；E 105.65°，N 28.13°）進(jìn)行。試驗(yàn)地點(diǎn)氣象概況：2—4月，煙草育苗棚內(nèi)溫濕度平均值分別為26.5℃和87%；4月中旬移栽后，天氣以陰到多云為主，平均氣溫16～20℃；5—9月，氣溫逐漸升高，降雨量豐富，光照充足。試驗(yàn)地土壤理化性狀：苗床期，1～5 mm基質(zhì)粒徑＞40%；容重0.15～0.35 mg·cm-3；總孔隙度70%～95%；電導(dǎo)率800 μS·cm-1；pH 5.0～6.8。移栽后土壤pH 6.45，有機(jī)質(zhì)含量處于中等水平，全氮1.80 g·kg-1，土壤堿解氮含量較豐富，速效磷36.60 mg·kg-1，速效鉀 275.40 mg·kg-1。

以當(dāng)?shù)刂髟云贩N中川208為供試材料。按照當(dāng)?shù)貎?yōu)質(zhì)煙葉技術(shù)規(guī)范，進(jìn)行育苗和栽培管理。要求試驗(yàn)煙苗健壯、無病蟲害，且長勢基本一致。漂浮育苗過程中的營養(yǎng)液為瀘州市煙草公司統(tǒng)一發(fā)放的煙草育苗專用肥配制，含有煙苗生長所需要的氮、磷、鉀、鐵、銅、硼、鋅和鉬等營養(yǎng)元素（N+P2O6+K2O≥50%）。

1.2 處理設(shè)計(jì)

在育苗期間分別設(shè)置單因素處理：不添加微生物菌劑（CK）和添加側(cè)孢芽孢桿菌（A）、枯草芽孢桿菌（B）、地衣芽孢桿菌（C），共4個(gè)處理，3種微生物菌劑的活菌數(shù)均大于100億·g-1。每處理3次重復(fù)，共12個(gè)小區(qū)。小區(qū)間利用黑膜將煙苗隔開。每小區(qū)四盤煙苗，每盤為160孔膨化聚苯乙烯漂盤，育苗盤規(guī)格為：57 cm×36 cm×6 cm，小區(qū)長×寬為：228 cm×144 cm，煙苗行距和株距均為3 cm左右。

微生物菌劑于出苗后，待煙苗長到小十字期時(shí)第1次施用。將3種微生物菌劑分別稀釋至濃度為1.5 g·L-1（每小區(qū)菌劑施加量為7.5 g，以5 L清水混勻）加入育苗營養(yǎng)液中。間隔10 d左右第2次施用，稀釋倍數(shù)（1.5 g·L-1）同第1次，施用方式為葉面噴施。于出苗后第50天觀察煙苗的生長發(fā)育狀況，并記錄其生長勢。各小區(qū)選擇有代表性的煙苗10株，記錄不同處理煙苗的整株鮮重、株高、莖圍、節(jié)距、最大葉長、最大葉寬、葉片數(shù)及根系主要指標(biāo)最長根長度、根鮮重、根表面積、根體積、及根系活力，煙苗根系生理指標(biāo)的測定主要包括超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）、過氧化氫酶（CAT）活性、丙二醛（MDA）和可溶性蛋白（SP）含量。

1.3 測定方法

1.3.1 煙草幼苗農(nóng)藝性狀和根系指標(biāo)的測定 于出苗后第50天進(jìn)行取樣。其中，煙苗農(nóng)藝性狀參照中國煙草行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)YC/T142-2010［8］進(jìn)行測定；根表面積和根體積使用甲烯藍(lán)法［9］測定；根系活力使用氯化三苯基四氮唑還原法［10］（TTC法）測定。

1.3.2 酶活性及相關(guān)指標(biāo)的測定 每個(gè)小區(qū)選擇有代表性的煙苗10株，于取樣當(dāng)天（出苗后第50天）測定根系抗氧化酶活性。其中，SOD活性采用氮藍(lán)四唑光化還原法［11］測定；POD活性采用愈創(chuàng)木酚比色法［12］測定；CAT活性采用紫外吸收法［13］測定。MDA含量采用硫代巴比妥酸法［14］測定；SP含量采用考馬斯亮藍(lán)G-250法［15］測定。

1.3.3 烤后煙葉常規(guī)化學(xué)成分檢測 取烤后煙葉C3F，使用近紅外光譜儀（MATRIX-1）進(jìn)行常規(guī)化學(xué)成分定量分析［16］。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2019和SPSS 20.0進(jìn)行數(shù)據(jù)整理和統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 微生物菌劑對烤煙幼苗農(nóng)藝性狀及根系生長勢的影響

由表1可知，施用微生物菌劑后，幼苗整株鮮重較CK顯著提高，且A處理又顯著高于B和C處理。微生物菌劑對煙草幼苗株高作用顯著，但3種菌劑間差異不顯著。A處理幼苗的莖圍和節(jié)距顯著高于CK和B、C處理。A處理幼苗的最大葉長值較高，B處理幼苗的最大葉寬較高，但A、B處理間差異不顯著。各處理幼苗的葉片數(shù)無顯著差異。綜上所述，側(cè)孢芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌對烤煙幼苗各項(xiàng)農(nóng)藝指標(biāo)有顯著增效作用，且側(cè)孢芽孢桿菌的效果最優(yōu)。對根系進(jìn)行分析，結(jié)果（表2）表明，A、B處理幼苗的單株根鮮重與CK無顯著差異，而C處理顯著低于CK。各處理幼苗的最長根長差異不顯著。A處理幼苗的根表面積顯著大于CK。A、B處理幼苗的根體積較CK顯著增加，且A處理又顯著高于B處理。綜上所述，施用側(cè)孢芽孢桿菌對烤煙幼苗根系發(fā)育具有顯著促進(jìn)作用，其幼苗根鮮重、最長根長度、根表面積和根體積均顯著增加。

表1 不同處理烤煙幼苗的農(nóng)藝性狀及根系指標(biāo)Table 1 Agronomic traits and root index of flue-cured tobacco seedlings under different treatments

2.2 對烤煙幼苗根系活力的影響

由圖1可知，A處理幼苗的根系活力顯著高于CK和B、C處理；而B、C處理幼苗的根系活力與CK差異不顯著。與CK相比，A處理幼苗的根系活力提高了62.26%；B、C處理分別提高了14.33%和5.81%。綜上所述，施用側(cè)孢芽孢桿菌促進(jìn)了烤煙幼苗的根系發(fā)育，提高了幼苗的抗逆性，從而增強(qiáng)了根系活力。

圖1 不同處理下烤煙幼苗的根系活力Fig.1 Root activities of flue-cured tobacco seedlings under different treatments

2.3 對烤煙幼苗根系超氧化物歧化酶活性的影響

由圖2可知，A、B處理幼苗根系中SOD活性顯著高于CK和A處理；C處理幼苗根系中SOD活性與CK間無顯著差異。由此表明，施用側(cè)胞芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌可提高煙草幼苗根系中SOD活性。

圖2 不同處理下煙草幼苗根系的超氧化物歧化酶活性Fig.2 SOD activities in roots of flue-cured tobacco seedlings under different treatments

2.4 對烤煙幼苗根系過氧化物酶活性的影響

由圖3可知，A、B、C處理幼苗根系中POD活性顯著高于CK，而3種菌劑間差異不明顯；其中，A處理烤煙幼苗根系中POD活性最高，為2.328 U·g-1·min-1。由此表明，施用微生物菌劑可能增加了漂浮育苗基質(zhì)的微生物活躍水平，使得根呼吸作用增強(qiáng)，從而促進(jìn)了根系生長發(fā)育，POD活性提高。

圖3 不同處理下煙草幼苗根系的過氧化物酶活性Fig.3 POD activities in roots of flue-cured tobacco seedlings under different treatments

2.5 對烤煙幼苗根系過氧化氫酶活性的影響

由圖4可知，A、B處理幼苗根系的CAT活性顯著高于CK和C處理，而C處理與CK間差異不顯著，A處理根系CAT活性又顯著高于B處理；即各處理幼苗根系CAT活性表現(xiàn)為：A＞B＞C、CK。其中，施用側(cè)胞芽孢桿菌后，幼苗根系CAT活性最高，較CK提高57%；施用枯草芽孢桿菌后較CK提高31%。

圖4 不同處理下煙草幼苗根系的過氧化氫酶活性Fig.4 CAT activities in roots of flue-cured tobacco seedlings under different treatments

2.6 對烤煙幼苗根系丙二醛含量的影響

由圖5可知，A、B處理幼苗根系中MDA的含量顯著低于CK和C處理，而C處理與CK之間差異不顯著，A處理又顯著低于B處理。A、B處理幼苗根系的MDA含量較CK分別降低了57%和32%。由于逆境脅迫下，會(huì)導(dǎo)致植株體內(nèi)MDA積累量增加，加重膜系統(tǒng)遭受活性氧毒害的程度［17］，而施用微生物菌劑A和B很大程度上地提高了烤煙幼苗的抗逆性，促進(jìn)了根系發(fā)育，使得根系中MDA含量顯著降低。

圖5 不同處理下煙草幼苗根系的丙二醛含量Fig.5 MDA contents in roots of flue-cured tobacco seedlings under different treatments

2.7 對烤煙幼苗根系可溶性蛋白含量的影響

由圖6可知，A處理幼苗根系中可溶性蛋白含量顯著高于CK，而B、C處理與CK之間差異不顯著。與CK相比，A處理使幼苗根系中可溶性蛋白含量增加14.8%，B和C處理略微增加。可溶性蛋白的親水性較強(qiáng)，能增加細(xì)胞的保水能力，從而提高植物的抗逆性［18］。施用側(cè)胞芽孢桿菌促進(jìn)了烤煙幼苗根系的發(fā)育，提高了幼苗的抗逆性，使得可溶性蛋白含量上升。

圖6 不同處理下煙草幼苗根系的可溶性蛋白含量Fig.6 SP contents in roots of flue-cured tobacco seedlings under different treatments

2.8 微生物菌劑育苗對烤后煙葉常規(guī)化學(xué)成分的影響

由表2可知，煙葉中還原糖含量為17.0%～28.0%，鉀含量均大于2.0%；氯含量較低，為0.2%～0.4%；煙堿含量1.8%～3.0%，符合優(yōu)質(zhì)煙葉標(biāo)準(zhǔn)；總糖含量16%～28%，其中，C處理總糖含量較低；總氮含量1.4%～2.2%，均符合優(yōu)質(zhì)煙葉標(biāo)準(zhǔn)；糖堿比8.5～13.5；氮堿比0.7～1.0，鉀氯比均大于4。不同處理進(jìn)行比較，B處理煙葉中還原糖含量最高，C處理煙葉中還原糖含量最低，且B、C處理與CK差異顯著；A、B、C處理煙葉中鉀含量顯著低于CK，其中A處理的降幅最小，為12.07%；A處理煙葉中氯含量顯著高于CK，B、C處理煙葉的氯含量顯著低于CK；A處理煙葉中煙堿含量顯著高于CK，B、C處理與CK差異不顯著；各處理煙葉中總糖含量均存在顯著差異，表現(xiàn)為：B＞A＞CK＞C；A處理煙葉中總氮含量顯著高于CK和B、C處理。綜上所述，施用側(cè)胞芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌的煙葉品質(zhì)更優(yōu)，其中施用側(cè)胞芽孢桿菌后煙葉化學(xué)成分含量較CK顯著提高。

表2 不同處理中部烤后煙葉的化學(xué)常規(guī)成分Table 2 Chemical components of central tobacco leaves under different treatments

2.9 微生物菌劑育苗對烤煙產(chǎn)值產(chǎn)量的影響

由表3可以看出，施用微生物菌劑處理的產(chǎn)量均高于CK。其中，A處理較CK增產(chǎn)35%；B和C處理較CK分別增加了30.2%和17.8%。且A、B、C處理的產(chǎn)值和均價(jià)也高于CK。其中，A處理的上等煙比例較高，較CK增加了24.3個(gè)百分點(diǎn)；中上等煙比例較CK增加16.4個(gè)百分點(diǎn)，因此，A處理的產(chǎn)值最高。由此表明，在苗期施用側(cè)胞芽孢桿菌能顯著提升中、上等煙比例，從而增加煙葉產(chǎn)值。

表3 不同處理烤煙的產(chǎn)值和產(chǎn)量Table 3 Output value and yield of flue-cured tobacco under different treatments

3 討論

瀘州煙區(qū)位于云、貴、川、渝交界處，大部分種植區(qū)處于山地?zé)熀椭泻０蔚赜颍虼藷煹夭煌耐寥拉h(huán)境成為影響煙葉品質(zhì)的主要因素之一［19］。微生物能將土壤有機(jī)質(zhì)分解轉(zhuǎn)化成腐殖質(zhì)，即將土壤中難吸收的大分子物質(zhì)轉(zhuǎn)化分解為可被植物吸收的小分子物質(zhì)，還可以分泌大量幾丁質(zhì)酶，阻止有害菌群侵入，防止病蟲害的發(fā)生，從而促進(jìn)煙草根系生長。本研究發(fā)現(xiàn)，苗期施用微生物菌劑后，烤煙幼苗的農(nóng)藝性狀和根系生長勢明顯提高，根系活力也得到了極大地提升，根系中抗氧化酶活性顯著增強(qiáng)，丙二醛含量顯著降低，可溶性蛋白含量增加，且烤制后煙葉的化學(xué)成分更加協(xié)調(diào)。

由于基質(zhì)和土壤中的大量元素?zé)o法被植物直接吸收，需經(jīng)過微生物的分解轉(zhuǎn)化釋放成為有效元素才能被植物吸收。因此，施用微生物菌劑能改善煙草根際微生態(tài)環(huán)境，從而提升煙葉品質(zhì)，是優(yōu)質(zhì)煙葉生產(chǎn)的有效栽培措施之一［20-21］。本研究發(fā)現(xiàn)，微生物菌劑對烤煙幼苗根系的生長發(fā)育有極大地促進(jìn)作用，可能是因?yàn)槲⑸锔纳屏丝緹熡缁|(zhì)的微生態(tài)環(huán)境，從而影響了烤煙苗期根際微生物狀態(tài)，但仍需進(jìn)一步研究。

根系活力是反映植物根系生長狀況最直接的指標(biāo)之一。沈杰等［22］發(fā)現(xiàn)，育苗基質(zhì)中添加10%的EM菌肥可顯著提高煙株幼苗的根系活力，促進(jìn)細(xì)根生長，增加幼苗干物質(zhì)積累，增強(qiáng)幼苗抗逆性。本研究發(fā)現(xiàn)，苗床期施用微生物菌劑能大幅度提高烤煙幼苗的根系活力，且不同菌劑的效果存在一定差異。其中，施用側(cè)孢芽孢桿菌對根系活力的增效作用最顯著。

抗氧化酶是植物體內(nèi)保護(hù)性酶，其活性的高低是植物抗逆水平的直接反映［23］。在漂浮育苗生產(chǎn)中，溫度的影響煙苗發(fā)育的重要因素之一，苗床期氣溫多變極易引發(fā)煙苗根系問題［24］。施用微生物菌劑增強(qiáng)了烤煙幼苗的根系活力，提高了根系中SOD、POD、CAT活性，一定程度上提高了烤煙幼苗的抗逆能力。丙二醛含量反映了膜脂過氧化的程度［25］，微生物菌劑處理后，幼苗根系中MDA含量顯著降低，這可能是由于抗氧化酶活性的增強(qiáng)清除了更多的自由基，使得丙二醛含量急劇下降。可溶性蛋白含量高低反映了植物細(xì)胞的保水狀態(tài)，施用微生物菌劑后，可溶性蛋白含量增加，表明烤煙幼苗根系的保水能力變強(qiáng)，根系生長發(fā)育狀況呈正向發(fā)展。

微生物菌劑提高了烤煙幼苗的抗逆性，增強(qiáng)烤煙幼苗的保護(hù)性酶活性，增加根系的保水能力，從而促進(jìn)幼苗根系的生長發(fā)育，有利于形成壯苗；為后期煙葉的高產(chǎn)和優(yōu)質(zhì)奠定了良好的基礎(chǔ)。因此，在瀘州煙區(qū)實(shí)際生產(chǎn)中，推薦將向煙草漂浮育苗營養(yǎng)液中添加側(cè)孢芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌作為烤煙育苗時(shí)期促進(jìn)根系生長發(fā)育的調(diào)控手段，促進(jìn)煙苗根系發(fā)育，培育壯苗。